Vi beskriver fluorescens photoactivation metoder för att analysera axonal transport av neurofilaments i enda myelinated axons av perifera nerver från transgena möss som uttrycker en photoactivatable neurofilament protein.
Neurofilamentproteinpolymerer rör sig längs axoner i den långsamma komponenten i axonaltransport vid genomsnittliga hastigheter på ~0,35-3,5 mm/dag. Tills nyligen studiet av denna rörelse in situ var endast möjligt med hjälp av radioisotopic puls-märkning, som tillåter analys av axonal transport i hela nerver med en tidsmässig upplösning av dagar och en rumslig upplösning av millimeter. För att studera neurofilament transport in situ med högre tidsmässiga och rumsliga upplösning, utvecklade vi en hThy1-paGFP-NFM transgenic mus som uttrycker neurofilament protein M taggade med photoactivatable GFP i nervceller. Här beskriver vi fluorescens fotoaktivering puls-escape och puls-spridning metoder för att analysera neurofilament transport i enda myelinated axoner av tibial nerver från dessa möss ex vivo. Isolerade nerv segment upprätthålls på mikroskopet skede genom perfusion med syresatt koksaltlösning och avbildas genom spinning disk confocal fluorescens mikroskopi. Violett ljus används för att aktivera fluorescensen i ett kort axonalfönster. Fluorescensen i de aktiverade och flankerande regionerna analyseras över tiden, vilket tillåter studiet av neurofilamenttransport med tidsmässig och rumslig upplösning på ordningen av minuter respektive mikrometer. Matematisk modellering kan användas för att extrahera kinetiska parametrar för neurofilament transport inklusive hastigheten, riktad bias och pausa beteende från de resulterande uppgifterna. De puls-flykt och puls-spridning metoder kan också anpassas för att visualisera neurofilament transport i andra nerver. Med utvecklingen av ytterligare transgena möss skulle dessa metoder också kunna användas för att avbilda och analysera axonaltransporten av andra cytoskeleala och cytosoliska proteiner i axoner.
Den axonal transport av neurofilaments först visades på 1970-talet genom radioisotopisk puls-märkning1. Detta tillvägagångssätt har gett en mängd information om neurofilament transport in vivo, men det har relativt låg rumslig och tidsmässig upplösning, typiskt på storleksordningen millimeter och dagar i bästafall 2. Dessutom är radioisotopisk pulsmärkning en indirekt metod som kräver injektion och uppoffring av flera djur för att generera en enda tidskurs. Med upptäckten av fluorescerande proteiner och framsteg i fluorescensmikroskopi på 1990-talet, blev det därefter möjligt att bilden neurofilament transport direkt i odlade nervceller på en tidsskala av sekunder eller minuter och med sub-mikrometer rumslig upplösning, vilket ger mycket större insikt i mekanismen för rörelse3. Dessa studier har visat att neurofilament polymerer i axoner rör sig snabbt och periodvis i både anterograde och bakåtsträvande riktningar längs mikrotubuli spår, drivs av mikrotubuli motorproteiner. Emellertid, neurofilaments är diffraktion-begränsade strukturer bara 10 nm i diameter som vanligtvis är fördelade bortsett från sina grannar av endast tiotals nanometer; därför kan polymererna endast spåras i odlade nervceller som innehåller glest fördelade neurofilament så att de rörliga polymererna kan lösas från sina grannar4. Det är alltså för närvarande inte möjligt att spåra enstaka neurofilament i axoner som innehåller rikliga neurofilament polymerer, såsom myelinerade axoner.
För att analysera axonal transport av neurofilaments i neurofilament-rika axoner med hjälp av fluorescensmikroskopi, använder vi en fluorescens fotoaktivering puls-escape metod som vi utvecklat för att studera den långsiktiga pausa beteende neurofilaments i odlade nervceller4,5. Neurofilaments taggade med en photoactivatable fluorescerande neurofilament fusion protein aktiveras i ett kort segment av axon, och sedan graden av avgång av dessa glödtrådar från den aktiverade regionen kvantifieras genom att mäta fluorescens sönderfall över tiden. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det är en analys på befolkningsnivå av neurofilamenttransport som kan appliceras på en tidsskala av minuter eller timmar utan att behöva spåra förflyttning av enskilda neurofilamentpolymerer. Till exempel har vi använt denna metod för att analysera kinetiken hos neurofilamenttransport i myelinerande kulturer6.
Nyligen beskrev vi utvecklingen av en hThy1-paGFP-NFM transgen mus som uttrycker låga nivåer av en paGFP-taggade neurofilament protein M (paGFP-NFM) i nervceller under kontroll av den mänskliga neuron-specifika Thy1 promotorn7. Denna mus tillåter analys av neurofilament transport in situ med hjälp av fluorescens mikroskopi. I den här artikeln beskriver vi de experimentella tillvägagångssätt för att analysera neurofilament transport i myelinated axoner av tibial nerver från dessa möss med hjälp av två tillvägagångssätt. Den första av dessa tillvägagångssätt är puls-escape-metoden som beskrivs ovan. Denna metod kan generera information om neurofilamentens pausande beteende, men är blind för den riktning i vilken glödtrådarna avgår den aktiverade regionen, och tillåter därför inte mätning av nettore riktadhet och transporthastighet8. Den andra av dessa metoder är en ny pulsspridningsmetod där vi analyserar inte bara förlusten av fluorescens från den aktiverade regionen, utan också den övergående ökningen av fluorescens i två flankerande fönster genom vilka de fluorescerande glödtrådarna rör sig när de avgår den aktiverade regionen i både anterograde och bakåtsträvande riktningar. I båda inflygningarna kan parametrar för neurofilamenttransport som den genomsnittliga hastigheten, nettore riktadhet och pausningsbeteende erhållas genom att använda matematisk analys och modellering av förändringarna i fluorescensen i mätrutorna. Bild 3 illustrerar dessa två tillvägagångssätt.
Detta protokoll visar dissekering och förberedelse av nerv, aktivering och bildframställning av paGFP fluorescens, och kvantifiering av neurofilament transport från de förvärvade bilderna med hjälp av FIJI distributionspaket av ImageJ9. Vi använder tibialnerven eftersom den är lång (flera cm) och förgrenar oss inte; dock i princip någon nerv uttrycker paGFP-NFM är lämpligt för användning med denna teknik om det kan dissekeras och de-mantlade utan att skada axoner.
Försiktighet måste tas vid analys av puls-flykt och puls-spridning experiment eftersom det finns betydande potential för införandet av fel under efterbearbetning, främst under platt-fält korrigering, bild anpassning och blekmedel korrigering. Flat-field korrigering är nödvändigt att korrigera för icke-enhetlighet i belysningen, vilket resulterar i en fall-off i intensitet över synfältet från centrum till periferi. Omfattningen av icke-enhetlighet är våglängdsberoende och därmed, bör alltid utföras vid …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Paula Monsma för instruktion och hjälp med confocal mikroskopi och tibial nerv dissekering och Dr Atsuko Uchida, Chloe Duger och Sana Chahande för hjälp med mus djurhållning. Detta arbete stöddes delvis av collaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 till A.B. och IOS1656765 till P.J., och National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 och S10 OD010383 till A.B. N.P.B. stöddes av en gemenskap från Ohio State University President’s Postdoctoral Scholars Program.
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
Calcium chloride | Fisher | C79 | |
Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
Potassium chloride | Fisher | P217 | |
Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |