Blod-hjernebarrieren (BBB) kan midlertidig forstyrres med mikrobubble-mediert fokusert ultralyd (FUS). Her beskriver vi en trinnvis protokoll for høy gjennomstrømning BBB-åpning in vivo ved hjelp av et modulært FUS-system tilgjengelig for ikke-ultralydeksperter.
Blod-hjernebarrieren (BBB) har vært et stort hinder for behandling av ulike hjernesykdommer. Endotelceller, forbundet med tette veikryss, danner en fysiologisk barriere som hindrer store molekyler (>500 Da) i å komme inn i hjernevevet. Mikrobubble-mediert fokusert ultralyd (FUS) kan brukes til å indusere en forbigående lokal BBB-åpning, slik at større stoffer kan komme inn i hjernen parenchyma.
I tillegg til store kliniske enheter for klinisk oversettelse, krever preklinisk forskning for terapiresponsvurdering av legemiddelkandidater dedikerte små dyre ultralydoppsett for målrettet BBB-åpning. Fortrinnsvis tillater disse systemene arbeidsflyter med høy gjennomstrømning med både høy romlig presisjon og integrert kavitasjonsovervåking, samtidig som de er kostnadseffektive i både innledende investeringer og driftskostnader.
Her presenterer vi et bioluminescens- og røntgenstyrt stereotaktisk fus-system for små dyr som er basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og oppfyller de nevnte kravene. Det er lagt særlig vekt på en høy grad av automatisering som letter utfordringene som typisk oppstår i prekliniske evalueringsstudier med høyt volum. Eksempler på disse utfordringene er behovet for standardisering for å sikre datareduserbarhet, redusere variasjon i intragruppen, redusere utvalgsstørrelsen og dermed overholde etiske krav og redusere unødvendig arbeidsbelastning. Det foreslåtte BBB-systemet er validert i omfanget av BBB-åpningen tilrettelagte legemiddelleveringsforsøk på pasientavledede xenograftmodeller av glioblastom multiforme og diffuse midline glioma.
Blod-hjernebarrieren (BBB) er et stort hinder for legemiddellevering i hjernen parenchyma. De fleste terapeutiske legemidler som er utviklet, krysser ikke BBB på grunn av deres fysisk-kjemiske parametere (f.eks. lipofilitet, molekylvekt, hydrogenbindings akseptorer og donorer) eller beholdes ikke på grunn av deres affinitet for eflukstransportører i hjernen1,2. Den lille gruppen medikamenter som kan krysse BBB er vanligvis små lipofile molekyler, som bare er effektive i et begrenset antall hjernesykdommer1,2. Som en konsekvens, for de fleste hjernesykdommer, er farmakologiske behandlingsalternativer begrenset og nye legemiddelleveringsstrategier er nødvendige3,4.
Terapeutisk ultralyd er en ny teknikk som kan brukes til forskjellige nevrologiske applikasjoner som BBB-forstyrrelse (BBBD), nevromodulering og ablasjon4,5,6,7. For å oppnå en BBB-åpning med en ekstrakorporeal ultralydemitter gjennom kraniet, kombineres fokusert ultralyd (FUS) med mikrobobler. Mikrobubble-mediert FUS resulterer i økt biotilgjengelighet av legemidler i hjernen parenchyma5,8,9. I nærvær av lydbølger begynner mikrobobler å svinge initiere transcytose og forstyrrelse av de tette kryssene mellom endotelcellene i BBB, noe som muliggjør paracellulær transport av større molekyler10. Tidligere studier bekreftet sammenhengen mellom intensiteten av det akustiske utslippet og den biologiske effekten på BBB-åpningen11,12,13,14. FUS i kombinasjon med mikrobobler har allerede blitt brukt i kliniske studier for behandling av glioblastom ved bruk av temozolomid eller liposomal doksorubicin som kjemoterapeutisk middel, eller til behandling av Alzheimers sykdom og amyotrofisk lateral sklerose5,9,15,16.
Siden ultralydmediert BBB-åpning resulterer i helt nye muligheter for farmakoterapi, er preklinisk forskning for klinisk oversettelse nødvendig for å vurdere behandlingsresponsen til utvalgte legemiddelkandidater. Dette krever vanligvis en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning med både høy romlig presisjon og helst en integrert kavitasjonsdeteksjon for overvåking av målrettet BBB-åpning med høy reproduserbarhet. Hvis det er mulig, må disse systemene være kostnadseffektive i både innledende investeringer og driftskostnader for å kunne skaleres i henhold til studiestørrelsen. De fleste prekliniske FUS-systemer kombineres med MR for image-veiledning og behandlingsplanlegging15,17,18,19. Selv om MR gir detaljert informasjon om tumoranatomien og volumet, er det en dyr teknikk, som vanligvis utføres av trente / dyktige operatører. I tillegg kan høyoppløselig MR ikke alltid være tilgjengelig for forskere i prekliniske anlegg og krever lange skannetider per dyr, noe som gjør den mindre egnet for farmakologiske studier med høy gjennomstrømning. Bemerkelsesverdig er at for preklinisk forskning innen nevro-onkologi, spesielt infiltrative tumormodeller, er muligheten til å visualisere og målrette svulsten avgjørende for behandlingssuksess20. For tiden er dette kravet bare oppfylt av MR eller av svulster transdusert med et fotoprotein, noe som muliggjør visualisering med bioluminescensavbildning (BLI) i kombinasjon med administrering av fotoproteinunderlaget.
MR-styrte FUS-systemer bruker ofte et vannbad for å sikre ultralydbølgeutbredelse for transkranielle applikasjoner, hvorved dyrets hode er delvis nedsenket i vannet, de såkalte ”bottom-up” systemene15,17,18. Selv om disse designene generelt fungerer godt i mindre dyrestudier, er de et kompromiss mellom dyreforberedelsestider, bærbarhet og realistisk vedlikeholdbare hygieniske standarder under bruk. Som et alternativ til MR omfatter andre veiledningsmetoder for stereotaktisk navigasjon bruk av et anatomisk gnageratlas21,22,23, laserpekerassistert visuell observasjon24, pinhole-assistert mekanisk skanneenhet25eller BLI26. De fleste av disse designene er “ovenfra og ned” -systemer der svingeren er plassert på toppen av dyrets hode, med dyret i en naturlig posisjon. Arbeidsflyten ”ovenfra og ned’ består av enten et vannbad22,25,26 eller en vannfylt kjegle21,24. Fordelen med å bruke en svinger i en lukket kjegle er det mer kompakte fotavtrykket, kortere oppsettstid og rett frem dekontamineringsmuligheter som forenkler hele arbeidsflyten.
Samspillet mellom det akustiske feltet med mikroboblene er trykkavhengig og spenner fra lav-amplitude oscillasjoner (referert til som stabil kavitasjon) til forbigående boblekollaps (referert til som inertiell kavitasjon)27,28. Det er en etablert konsensus om at ultralyd-BBBD krever et akustisk trykk godt over den stabile kavitasjonsterskelen for å oppnå vellykket BBBD, men under den inertiske kavitasjonsterskelen, som generelt er forbundet med vaskulær / nevronskade29. Den vanligste formen for overvåking og kontroll er analysen av det (bak)spredte akustiske signalet ved hjelp av passiv kavitasjonsdeteksjon (PCD), som foreslått av McDannold et al.12. PCD er avhengig av analysen av Fourier-spektraet av mikrobubble utslippssignaler, der styrken og utseendet til stabile kavitasjonsmerker (harmonikk, subharmonikk og ultraharmonikk) og inertial kavitasjonsmarkører (bredbåndsrespons) kan måles i sanntid.
En “one size fits all” PCD-analyse for presis trykkkontroll er komplisert på grunn av mikrobubbleformuleringens polydispersitet (oscillasjonsamplituden avhenger sterkt av boblediameteren), forskjellene i bobleskallegenskaper mellom merker og akustisk oscillasjon, som avhenger sterkt av frekvens og trykk30,31,32. Som en konsekvens er det foreslått mange forskjellige PCD-deteksjonsprotokoller, som er tilpasset bestemte kombinasjoner av alle disse parametrene og har blitt brukt i ulike applikasjonsscenarier (alt fra in vitro-eksperimentering over små dyreprotokoller til PCD for klinisk bruk) for robust kavitasjonsdeteksjon og til og med for tilbakevirkende tilbakemeldingskontroll av trykket11,14,30,31,32,33,34,35. PCD-protokollen som brukes i omfanget av denne studien er avledet direkte fra McDannold et al.12 og overvåker det harmoniske utslippet for tilstedeværelse av stabil kavitasjon og bredbåndsstøy for inertiell kavitasjonsdeteksjon.
Vi har utviklet et bildestyrt neuronavigation FUS-system for forbigående åpning av BBB for å øke legemiddeltilførselen til hjerneparenchyma. Systemet er basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og kan enkelt tilpasses flere forskjellige bildemodaliteter, avhengig av tilgjengelige bildeteknikker i dyreanlegget. Siden vi trenger en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning, har vi valgt å bruke røntgen og BLI til bildeveiledning og behandlingsplanlegging. Tumorceller transdusert med fotoprotein (f.eks. luciferase) er egnet for BLI-avbildning20. Etter administrering av fotoprotein substratet kan tumorceller overvåkes in vivo og tumorvekst og plassering kan bestemmes20,36. BLI er en rimelig bildebehandlingsmodalitet, det gjør det mulig å følge svulstveksten over tid, den har raske skannetider og det korrelerer godt med tumorvekst målt med MR36,37. Vi har valgt å erstatte vannbadet med en vannfylt kjegle festet til svingeren for å muliggjøre fleksibilitet til fritt å flytte plattformen som gnageren er montertpå 8,24. Designet er basert på en avtakbar plattform utstyrt med integrasjon av (I) smådyr stereotaktiske plattform (II) fiducial markører med både røntgen- og optisk bildekompatibilitet (III) hurtigavtakbar anestesimaske, og (IV) integrert temperaturregulert dyreoppvarmingssystem. Etter den første induksjonen av anestesi, er dyret montert i en presis posisjon på plattformen der den forblir under hele prosedyren. Følgelig passerer hele plattformen alle stasjoner i arbeidsflyten for hele intervensjonen, samtidig som den opprettholder en nøyaktig og reproduserbar posisjonering og vedvarende anestesi. Kontrollprogramvaren tillater automatisk deteksjon av fiducial markører og registrerer automatisk alle typer bilder og bildemodaliteter (dvs. mikro-CT, røntgen, BLI og fluorescensavbildning) i referanserammen til den stereotaktiske plattformen. Ved hjelp av en automatisk kalibreringsprosedyre er fokuslengden på ultralydtransduseren nettopp kjent innen, noe som muliggjør automatisk fusjon av intervensjonsplanlegging, akustisk levering og oppfølgingsavbildningsanalyse. Som vist i figur 1 og figur 2, gir dette oppsettet en høy grad av fleksibilitet til å designe dedikerte eksperimentelle arbeidsflyter og tillater sammenflettet håndtering av dyret på forskjellige stasjoner, noe som igjen letter eksperimenter med høy gjennomstrømning. Vi har brukt denne teknikken for vellykket legemiddellevering i mus xenografts av høyverdig glioma som diffus midline glioma.
I denne studien utviklet vi et kostnadseffektivt bildestyrt basert FUS-system for forbigående BBB-forstyrrelser for økt legemiddellevering i hjerneparenchyma. Systemet ble i stor grad bygget med kommersielt tilgjengelige komponenter og i forbindelse med røntgen og BLI. Modulariteten til den foreslåtte utformingen tillater bruk av flere bildemodaliteter for planlegging og vurdering i arbeidsflyter med høy gjennomstrømning. Systemet kan kombineres med mer omfattende høyoppløselige 3D-avbildningsmodaliteter, for eks…
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble finansiert av KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Vi takker Ilya Skachkov og Charles Mougenot for deres innspill i utviklingen av systemet.
1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |