Summary

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

Published: July 16, 2020
doi:

Summary

La barrera hematoencefálica (BBB) se puede interrumpir temporalmente con ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS). Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la apertura de BBB de alto rendimiento in vivo utilizando un sistema FUS modular accesible para expertos que no son de ultrasonido.

Abstract

La barrera hematoencefálica (BBB) ha sido un obstáculo importante para el tratamiento de diversas enfermedades cerebrales. Las células endoteliales, conectadas por uniones estrechas, forman una barrera fisiológica que impide que moléculas grandes (>500 Da) entren en el tejido cerebral. El ultrasonido enfocado mediado por microburbujas (FUS) se puede utilizar para inducir una apertura local transitoria de BBB, permitiendo que fármacos más grandes entren en el parénquima cerebral.

Además de los dispositivos clínicos a gran escala para la traducción clínica, la investigación preclínica para la evaluación de la respuesta a la terapia de los candidatos a fármacos requiere configuraciones de ultrasonido de animales pequeños dedicados para la apertura de BBB dirigida. Preferiblemente, estos sistemas permiten flujos de trabajo de alto rendimiento con alta precisión espacial, así como monitoreo de cavitación integrado, al tiempo que siguen siendo rentables tanto en la inversión inicial como en los costos de funcionamiento.

Aquí, presentamos un sistema FUS de animales pequeños estereotáctico guiado por bioluminiscencia y rayos X que se basa en componentes disponibles comercialmente y cumple con los requisitos mencionados anteriormente. Se ha hecho especial hincapié en un alto grado de automatización que facilita los desafíos que suelen encontrarse en los estudios preclínicos de alto volumen de evaluación de fármacos. Ejemplos de estos desafíos son la necesidad de estandarización para garantizar la reproducibilidad de los datos, reducir la variabilidad dentro del grupo, reducir el tamaño de la muestra y, por lo tanto, cumplir con los requisitos éticos y disminuir la carga de trabajo innecesaria. El sistema BBB propuesto se ha validado en el alcance de los ensayos de administración de fármacos facilitados por la apertura de BBB en modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de glioblastoma multiforme y glioma difuso de línea media.

Introduction

La barrera hematoencefálica (BBB) es un obstáculo importante para la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. La mayoría de los fármacos terapéuticos que se han desarrollado no cruzan el BBB debido a sus parámetros fisicoquímicos (por ejemplo, lipofilia, peso molecular, aceptores de enlaces de hidrógeno y donantes) o no se retienen debido a su afinidad por los transportadores de eflujo en el cerebro1,2. El pequeño grupo de fármacos que pueden atravesar el BBB son típicamente pequeñas moléculas lipofílicas, que sólo son eficaces en un número limitado de enfermedades cerebrales1,2. Como consecuencia, para la mayoría de las enfermedades cerebrales, las opciones de tratamiento farmacológico son limitadas y se necesitan nuevas estrategias de administración de fármacos3,4.

El ultrasonido terapéutico es una técnica emergente que se puede utilizar para diferentes aplicaciones neurológicas como la interrupción de BBB (BBBD), la neuromodulación y la ablación4,5,6,7. Para lograr una apertura de BBB con un emisor de ultrasonido extracorpóreo a través del cráneo, el ultrasonido enfocado (FUS) se combina con microburbujas. Fus mediada por microburbujas resulta en un aumento de la biodisponibilidad de los fármacos en el parénquima cerebral5,8,9. En presencia de ondas sonoras, las microburbujas comienzan a oscilar iniciando la transcitosis y la interrupción de las uniones estrechas entre las células endoteliales del BBB, permitiendo el transporte paracelular de moléculas más grandes10. Estudios previos confirmaron la correlación entre la intensidad de la emisión acústica y el impacto biológico en la apertura BBB11,12,13,14. Fus en combinación con microburbujas ya se ha utilizado en ensayos clínicos para el tratamiento del glioblastoma utilizando temozolomida o doxorrubicina liposomal como agente quimioterapéutico, o para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica5,9,15,16.

Puesto que el ultrasonido medió los resultados de la abertura de BBB en las posibilidades enteramente nuevas para la farmacoterapia, la investigación preclínica para la traducción clínica es necesaria evaluar la respuesta de la terapia de candidatos seleccionados de la droga. Esto normalmente requiere un flujo de trabajo de alto rendimiento con alta precisión espacial y preferiblemente una detección de cavitación integrada para la supervisión de la apertura BBB dirigida con una alta reproducibilidad. Si es posible, estos sistemas deben ser rentables tanto en la inversión inicial como en los costos de funcionamiento para ser escalables de acuerdo con el tamaño del estudio. La mayoría de los sistemas fus preclínicos se combinan con mri para la imagen-dirección y la planificación del tratamiento15,17,18,19. Aunque la RMN proporciona información detallada sobre la anatomía y el volumen del tumor, es una técnica costosa, que generalmente es realizada por operadores capacitados /calificados. Además, la RMN de alta resolución puede no estar siempre disponible para los investigadores en instalaciones preclínicas y requiere largos tiempos de exploración por animal, lo que la hace menos adecuada para estudios farmacológicos de alto rendimiento. Cabe destacar que, para la investigación preclínica en el campo de la neurooncología, en particular los modelos tumorales infiltrativos, la posibilidad de visualizar y atacar el tumor es esencial para el éxito del tratamiento20. Actualmente, este requisito sólo se cumple por RMN o por tumores transducidos con una fotoproteína, lo que permite la visualización con imágenes de bioluminiscencia (BLI) en combinación con la administración del sustrato fotoproteico.

Los sistemas FUS guiados por RMN a menudo utilizan un baño de agua para asegurar la propagación de ondas de ultrasonido para aplicaciones transcraneales, mediante el cual la cabeza del animal está parcialmente sumergida en el agua, los llamados sistemas ”bottom-up”15,17,18. Si bien estos diseños funcionan generalmente bien en estudios con animales más pequeños, son un compromiso entre los tiempos de preparación de los animales, la portabilidad y los estándares higiénicos realistas y mantenibles durante el uso. Como alternativa a la RMN, otros métodos de guía para la navegación estereotáctica abarcan el uso de un atlas anatómico de roedores21,22, 23,avistamiento visual asistido por puntero láser24,dispositivo de escaneo mecánico asistido por agujero de alfiler25o BLI26. La mayoría de estos diseños son sistemas “de arriba hacia abajo” en los que el transductor se coloca en la parte superior de la cabeza del animal, con el animal en una posición natural. El flujo de trabajo ”de arriba hacia abajo” consiste en un baño de agua22,25,26 o un cono lleno de agua21,24. La ventaja de usar un transductor dentro de un cono cerrado es la huella más compacta, el menor tiempo de configuración y las posibilidades de descontaminación directa que simplifican todo el flujo de trabajo.

La interacción del campo acústico con las microburbujas depende de la presión y va desde oscilaciones de baja amplitud (denominadas cavitación estable) hasta colapso transitorio de burbujas (denominada cavitación inercial)27,28. Existe un consenso establecido de que la ECOGRAFÍA-BBBD requiere una presión acústica muy por encima del umbral de cavitación estable para lograr una BBBD exitosa, pero por debajo del umbral de cavitación inercial, que generalmente se asocia con daño vascular/neuronal29. La forma más común de monitoreo y control es el análisis de la señal acústica (retro)dispersada utilizando la detección pasiva de cavitación (PCD), como sugieren McDannold et al.12. Pcd se basa en el análisis de los espectros de Fourier de señales de emisión de microburbujas, en el que la fuerza y la apariencia de los sellos de cavitación estables (armónicos, subharmonics y ultraharmonics) y los marcadores de cavitación inercial (respuesta de banda ancha) se pueden medir en tiempo real.

Un análisis pcd de “talla única” para un control preciso de la presión es complicado debido a la polidispersidad de la formulación de microburbujas (la amplitud de la oscilación depende fuertemente del diámetro de la burbuja), las diferencias en las propiedades de la cáscara de la burbuja entre las marcas y la oscilación acústica, que depende fuertemente de la frecuencia y la presión30,31,32. Como consecuencia, se han sugerido muchos protocolos diferentes de detección de PCD, que se han adaptado a combinaciones particulares de todos estos parámetros y se han utilizado en varios escenarios de aplicación (que van desde la experimentación in vitro sobre protocolos de pequeños animales hasta PCD para uso clínico) para la detección de cavitación robusta e incluso para el control de retroalimentación retroactiva de la presión11,14,30,31,32,33,34,35. El protocolo PCD empleado en el alcance de este estudio se deriva directamente de McDannold et al.12 y monitorea la emisión armónica para la presencia de cavitación estable y ruido de banda ancha para la detección de cavitación inercial.

Hemos desarrollado un sistema de FUS de neuronavegación guiada por imágenes para la apertura transitoria del BBB para aumentar la entrega de fármacos en el parénquima cerebral. El sistema se basa en componentes disponibles comercialmente y se puede adaptar fácilmente a varias modalidades de imágenes diferentes, dependiendo de las técnicas de imagen disponibles en la instalación animal. Dado que requerimos un flujo de trabajo de alto rendimiento, hemos optado por utilizar rayos X y BLI para la orientación por imágenes y la planificación del tratamiento. Las células tumorales transducidas con una fotoproteína (por ejemplo, luciferasa) son adecuadas para la obtención de imágenesBLI 20. Después de la administración del sustrato de fotoproteínas, las células tumorales pueden ser monitoreadas in vivo y el crecimiento y la ubicación del tumor se pueden determinar20,36. BLI es una modalidad de imagen de bajo costo, permite seguir el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo, tiene tiempos de exploración rápidos y se correlaciona bien con el crecimiento tumoral medido con MRI36,37. Hemos optado por sustituir el baño de agua por un cono lleno de agua unido al transductor para permitir flexibilidad para mover libremente la plataforma sobre la que está montado el roedor8,24. El diseño se basa en una plataforma desmontable equipada con la integración de (I) plataforma estereotáctica de animales pequeños (II) marcadores fiduciales con rayos X y compatibilidad de imágenes ópticas (III) máscara de anestesia desmontable rápida, y (IV) sistema integrado de calentamiento de animales regulados por temperatura. Después de la inducción inicial de la anestesia, el animal se monta en una posición precisa en la plataforma donde permanece durante todo el procedimiento. En consecuencia, toda la plataforma pasa por todas las estaciones del flujo de trabajo de toda la intervención, manteniendo un posicionamiento preciso y reproducible y anestesia sostenida. El software de control permite la detección automática de los marcadores fiduciales y registra automáticamente todo tipo de imágenes y modalidades de imagen (es decir, micro-CT, rayos X, BLI e imágenes de fluorescencia) en el marco de referencia de la plataforma estereotáctica. Con la ayuda de un procedimiento de calibración automática, la distancia focal del transductor de ultrasonido se conoce con precisión dentro, lo que permite la fusión automática de la planificación intervencionista, la entrega acústica y el análisis de imágenes de seguimiento. Como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2,esta configuración proporciona un alto grado de flexibilidad para diseñar flujos de trabajo experimentales dedicados y permite el manejo intercalado del animal en diferentes estaciones, lo que a su vez facilita los experimentos de alto rendimiento. Hemos utilizado esta técnica para la entrega acertada de la droga en xenografts del ratón de la glioma de alto grado tal como glioma difuso del midline.

Protocol

Todos los experimentos in vivo fueron aprobados por el comité ético holandés (número de permiso de licencia AVD114002017841) y el Organismo de Bienestar Animal de la Vrije Universiteit Amsterdam, Países Bajos. Los investigadores fueron entrenados en los fundamentos del sistema FUS con el fin de minimizar las molestias de los animales. 1. Sistema de ultrasonido enfocado NOTA: La configuración descrita es un sistema de interrupción BBB construido en casa basado e…

Representative Results

El sistema FUS descrito(Figura 1 y Figura 2)y el flujo de trabajo asociado se han utilizado en más de 100 animales y han producido datos reproducibles en ratones sanos y osos. Sobre la base de la cavitación registrada y la densidad espectral en los armónicos en el momento pico de la inyección en bolo de microburbujas, la potencia espectral de cada frecuencia se puede calcular utilizando el análisis de Fourier como se explica en el paso 4 del Protocolo. Basa…

Discussion

En este estudio, desarrollamos un sistema fus basado guiado imagen rentable para la interrupción transitoria de BBB para la entrega creciente de la droga en la parenquimia del cerebro. El sistema fue construido en gran parte con componentes disponibles comercialmente y en conjunto con rayos X y BLI. La modularidad del diseño propuesto permite el uso de varias modalidades de imágenes para la planificación y evaluación en flujos de trabajo de alto rendimiento. El sistema se puede combinar con modalidades de imágenes …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto fue financiado por el KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Damos las gracias a Ilya Skachkov y Charles Mougenot por sus aportaciones al desarrollo del sistema.

Materials

1 mL luer-lock syringe Becton Dickinson 309628 Plastipak
19 G needle Terumo Agani 8AN1938R1
23 G needle Terumo Agani 8AN2316R1
3M Transpore surgical tape Science applied to life 7000032707 or similar
Arbitrary waveform generator Siglent n.a. SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact in-house built n.a. Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme Bruker n.a. Includes software
Buffered NaCl solution B. Braun Melsungen AG 220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride Indivior UK limitd n.a. 0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home Bio services n.a.
Carbon filter Bickford NC0111395 Omnicon f/air
Ceramic spoon n.a n.a.
Cotton swabs n.a. n.a.
D-luciferin, potassium salt Gold Biotechnology LUCK-1
Ethanol VUmc pharmacy n.a. 70%
Evans Blue Sigma Aldrich E2129
Fresenius NaCl 0.9% Fresenius Kabi n.a. NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl Braun Surgical n.a. Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone Precision Acoustics n.a.
Insulin syringe Becton Dickinson 324825/324826 0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane TEVA Pharmachemie BV 8711218013196 250 mL
Ketamine Alfasan n.a. 10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet Envigo 2918-11416M
Neoflon catheter Becton Dickinson 391349 26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope Keysight technologies n.a. InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes Greiner bio-one 210261 50 mL
Power amplifier Electronics & Innovation Ltd 210L Model 210L
Preamplifier DC Coupler Precision Acoustics n.. Serial number: DCPS94
Scissors Sigma Aldrich S3146-1EA or similar
Sedazine AST Farma n.a. 2%
SonoVue microbubbles Bracco n.a. 8 µl/ml
Sterile water Fresenius Kabi n.a. 1000 mL
Syringe n.a. n.a. various syringes can be used
Temgesic Indivior UK limitd n.a. 0.3 mg/ml
Transducer Precision Acoustics n.a. 1 MHz
Tweezers Sigma Aldrich F4142-1EA or similar
Ultrasound gel Parker Laboratories Inc. 01-02 Aquasonic 100
Vidisic gel Bausch + Lomb n.a. 10 g

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Haumann, R., ’t Hart, E., Derieppe, M. P. P., Besse, H. C., Kaspers, G. J. L., Hoving, E., van Vuurden, D. G., Hulleman, E., Ries, M. A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents. J. Vis. Exp. (161), e61269, doi:10.3791/61269 (2020).

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