Modelado de metástasis cerebrales a través de inyección intracraneal e imágenes de resonancia magnética

Summary

El modelado intracraneal de metástasis cerebral se complica por la incapacidad para controlar el tamaño del tumor y la respuesta al tratamiento con métodos precisos y oportunos. La metodología presentada combina la inyección de tumores intracraneales con el análisis de imágenes por resonancia magnética, que cuando se combina, cultiva inyecciones precisas y consistentes, monitorización animal mejorada y mediciones precisas del volumen tumoral.

Abstract

La propagación metastásica del cáncer es una consecuencia desafortunada de la progresión de la enfermedad, los subtipos de cáncer agresivos y/o el diagnóstico tardío. Las metástasis cerebrales son particularmente devastadoras, difíciles de tratar y confieren un mal pronóstico. Si bien la incidencia precisa de metástasis cerebrales en los Estados Unidos sigue siendo difícil de estimar, es probable que aumente a medida que las terapias extracraneales continúan siendo más eficaces en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, es necesario identificar y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para tratar la metástasis en este sitio. Con este fin, la inyección intracraneal de células cancerosas se ha convertido en un método bien establecido en el que modelar la metástasis cerebral. Anteriormente, la incapacidad para medir directamente el crecimiento tumoral ha sido un obstáculo técnico para este modelo; sin embargo, el aumento de la disponibilidad y la calidad de las modalidades de imágenes de animales pequeños, como la resonancia magnética (RM), están mejorando enormemente la capacidad de monitorear el crecimiento tumoral con el tiempo e inferir cambios dentro del cerebro durante el período experimental. En este documento, se demuestra la inyección intracraneal de células tumorales mamarias murinas en ratones inmunocompetentes seguidos de resonancia magnética. El enfoque de inyección presentado utiliza anestesia de isoflurano y una configuración estereotáctica con un taladro automatizado controlado digitalmente e inyección de aguja para mejorar la precisión y reducir los errores técnicos. La RMN se mide con el tiempo utilizando un instrumento 9.4 Tesla en la Universidad Estatal de Ohio James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Las mediciones del volumen tumoral se demuestran en cada momento mediante el uso de ImageJ. En general, este enfoque de inyección intracraneal permite la inyección precisa, el monitoreo diario y las mediciones precisas del volumen tumoral, que combinadas mejoran en gran medida la utilidad de este sistema modelo para probar nuevas hipótesis sobre los controladores de metástasis cerebrales.

Introduction

Las metástasis cerebrales son 10 veces más frecuentes que los tumores adultos del sistema nervioso central primario^1,y se han notificado en casi todos los tipos de tumores sólidos con cáncer de pulmón, cáncer de mama y melanoma que presentan la mayor incidencia^2. Independientemente del sitio del tumor primario, el desarrollo de metástasis cerebral conduce a un mal pronóstico a menudo asociado con deterioro cognitivo, dolores de cabeza persistentes, convulsiones, cambios de comportamiento y/o personalidad^1,,3,,4,,5. En términos de cáncer de mama, ha habido muchos avances en la prevención y tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, el 30% de las mujeres diagnosticadas con cáncer de mama desarrollarán metástasis, y de las que padecen enfermedad en estadio IV, aproximadamente el 7% (SEER 2010-2013) tienen metástasis cerebral^6,,7. Las opciones de tratamiento actuales para la metástasis cerebral implican resección quirúrgica, radiocirugía estereotáctica y/o radioterapia cerebral completa. Sin embargo, incluso con esta terapia agresiva, la mediana de supervivencia para estos pacientes es un corto de 8-11^{meses 7,8,9}. Estas sombrías estadísticas apoyan firmemente la necesidad de identificar e implementar estrategias terapéuticas nuevas y eficaces. Por lo tanto, al igual que con todos los tipos de cáncer que hacen metástasis en el cerebro, es esencial modelar adecuadamente la metástasis cerebral asociada al cáncer de mama (BCBM) en el laboratorio para asegurar avances significativos en el campo.

Hasta la fecha, los investigadores han utilizado una variedad de metodologías para estudiar mecanismos de metástasis en el cerebro, cada uno con claras ventajas y limitaciones^10,,11. Los métodos experimentales de metástasis, como la vena de cola y la inyección intracardiaca, propagan las células tumorales por todo el cuerpo y pueden resultar en una inmensa carga tumoral en otros sitios metastásicos dependiendo de las células inyectadas. Estos resultados son entonces confusos si estudian específicamente la metástasis en el cerebro. El método de inyección de la arteria intracarótida es ventajoso, ya que se dirige específicamente a la siembra cerebral de las células tumorales, pero está limitado, ya que puede ser técnicamente difícil de realizar. La resección ortotópica del tumor primario se considera a menudo el modelo clínicamente más relevante de metástasis, ya que recapitula toda la cascada metastásica. Sin embargo, este enfoque implica períodos de espera prolongados para que se produzca metástasis espontánea con tasas dramáticamente más bajas de metástasis cerebral en comparación con los otros sitios metastásicos como el ganglio linfático, el pulmón y el hígado. A menudo, los animales deben ser retirados de los estudios debido a la carga tumoral en estos otros sitios metastásicos antes del desarrollo de metástasis cerebral. Otros métodos que involucran líneas celulares trópicas del cerebro son eficaces en la metástasis en el cerebro; sin embargo, estos modelos son limitados en que toman tiempo para desarrollarse y a menudo pierden su tropismo con la propagación. Dadas estas limitaciones, los investigadores han utilizado rutinariamente el método de inyección intracraneal para modelar la metástasis del cáncer en el cerebro^11,12,13,14 con diversas metodologías^{15,16,17,18,19}. Se reconoce que este enfoque tiene limitaciones de manera similar, lo más importante en que no permite la investigación de los primeros pasos metastásicos incluyendo la intravasación fuera del tumor primario, la penetración a través de la barrera hematoencefálica, y el establecimiento dentro del cerebro. Sin embargo, permite a los investigadores probar (1) qué factores derivados del tumor median el crecimiento dentro del cerebro (por ejemplo, manipulación genética de un factor oncogénico en las células tumorales), (2) cómo los cambios en el microambiente metastásico alteran el crecimiento del cáncer en este sitio (por ejemplo, la comparación entre ratones transgénicos con componentes estromales alterados) y (3) la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas sobre el crecimiento de lesiones establecidas.

Dada la utilidad potencial del modelo de inyección intracraneal, es absolutamente necesario reducir el error técnico durante la inyección y controlar con precisión el crecimiento tumoral con el tiempo. El método descrito en este documento implica la dosificación continua de la anestesia por gas inhalado, y la implantación directa de células tumorales en el parénquima cerebral mediante un taladro estereotáctico y un soporte de inyección. La administración de anestesia de gas permite ajustar con precisión la profundidad y la longitud de la anestesia, así como garantizar una recuperación rápida y suave. Un sistema de inyección de aguja y taladro automatizado controlado digitalmente mejora la precisión del lugar de inyección y reduce los errores técnicos que a menudo incurren en los métodos de perforación e inyección a mano libre. El uso de imágenes por resonancia magnética (RM) aumenta aún más la precisión en el control del crecimiento tumoral, el volumen tumoral, la respuesta tisular, la necrosis tumoral y la respuesta al tratamiento. La RMN es la modalidad de imagen de elección para los tejidos blandos^20,,21. Esta técnica de diagnóstico por imágenes no utiliza radiación ionizante y se prefiere sobre la Tomografía Computarizada (TC), especialmente para varias sesiones de diagnóstico por imágenes durante el transcurso de un estudio. La RMN tiene una gama mucho mayor de contraste de tejido blando disponible que la TC o la ecografía (USG) y presenta la anatomía con mayor detalle. Es más sensible y específico para las anomalías dentro del propio cerebro. La RMN se puede realizar en cualquier plano de imagen sin tener que mover físicamente el sujeto como es el caso en la imagen óptica 2D USG o 2D. Es importante mencionar que el cráneo no atenúa la señal de RMN como en otras modalidades de diagnóstico por imágenes. La RMN permite la evaluación de estructuras que pueden ser oscurecidas por artefactos de hueso en TC o USG. Una ventaja adicional es que hay muchos agentes de contraste disponibles para la RMN, lo que mejora el límite de detección de lesiones, con relativamente baja toxicidad o efectos secundarios. Es importante destacar que la RMN permite el monitoreo en tiempo real a diferencia de la evaluación histológica en el momento de la necropsia, que es limitada en el descifrado del volumen tumoral. Otras modalidades de diagnóstico por imágenes, como las imágenes bioluminiscentes, son eficaces para la detección y el seguimiento tempranos de tumores a lo largo del tiempo; sin embargo, este método requiere manipulación genética (por ejemplo, etiquetado de luciferasa/GFP) de las líneas celulares y no permite mediciones volumétricas. La RMN es más ventajosa, ya que refleja la monitorización del paciente y se sabe que el análisis volumétrico aguas abajo de las imágenes de RMN está fuertemente correlacionado con el tamaño del tumor histológico en la necropsia^22. La monitorización en serie con detección de RMN también aumenta el seguimiento clínico de las deficiencias neurológicas, en caso de que surjan.

En general, el método presentado de inyección de tumores intracraneales estereotácticos seguido de una resonancia magnética en serie nos permite producir resultados fiables, predecibles y medibles para estudiar los mecanismos de metástasis cerebral en el cáncer.

Protocol

Todos los métodos descritos en este documento han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad Estatal de Ohio (P.I. Gina Sizemore; Protocolo #2007A0120). Se siguen todas las políticas de cirugía de supervivencia de roedores IACUC, incluyendo el uso de técnicas estériles, suministros, instrumentos, así como la eliminación de pieles y la preparación estéril del sitio de la incisión. 1. Inyección intracraneal de células de cáncer d…

Representative Results

En la Figura 3 se describe la cuantificación del volumen tumoral de un solo ratón en dos puntos de tiempo (día 7 y día 10) después de la inyección de células tumorales mamarias murinas. Para este experimento, se inyectaron 50.000 células DB7, y el cerebro del animal fue evaluado por resonancia magnética. Para cada escaneo, se capturaron 30 rodajas (0,5 mm de espesor). La evaluación de las 30 rebanadas por exploración reveló que en el día 7 después de la inyección, 5 rebanadas …

Discussion

La utilización de la inyección intracraneal seguida de la monitorización en serie con RMN proporciona la capacidad única de visualizar el crecimiento tumoral con precisión del volumen tumoral a lo largo del tiempo. La aplicación del análisis de imágenes digitales permite la interpretación de lesiones cerebrales para el volumen tumoral, hemorragia, necrosis y respuesta al tratamiento.

Al igual que con cualquier procedimiento, hay pasos clave que deben seguirse para el éxito. En primer…

Materials

Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters