Modélisation des métastases cérébrales par injection intracrânienne et imagerie par résonance magnétique

Summary

La modélisation intracrânienne de métastase de cerveau est compliquée par une incapacité de surveiller la taille et la réponse de tumeur au traitement avec des méthodes précises et opportunes. La méthodologie présentée couple l’injection intracrânienne de tumeur avec l’analyse de formation image de résonance magnétique, qui une fois combinée, cultive des injections précises et cohérentes, la surveillance accrue d’animal, et les mesures précises de volume de tumeur.

Abstract

La propagation métastatique du cancer est une conséquence malheureuse de la progression de la maladie, des sous-types agressifs de cancer et/ou du diagnostic tardif. Les métastases cérébrales sont particulièrement dévastatrices, difficiles à traiter et confèrent un mauvais pronostic. Bien que l’incidence précise des métastases cérébrales aux États-Unis demeure difficile à estimer, elle est susceptible d’augmenter à mesure que les thérapies extracrâniens continuent de devenir plus efficaces dans le traitement du cancer. Ainsi, il est nécessaire d’identifier et de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter la métastase à ce site. À cette fin, l’injection intracrânienne de cellules cancéreuses est devenue une méthode bien établie pour modéliser la métastase cérébrale. Précédemment, l’incapacité de mesurer directement la croissance de tumeur a été un obstacle technique à ce modèle ; cependant, l’augmentation de la disponibilité et de la qualité des modalités d’imagerie des petits animaux, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), améliorent considérablement la capacité de surveiller la croissance tumorale au fil du temps et inférer les changements dans le cerveau au cours de la période expérimentale. Ici, l’injection intracrânienne des cellules mammaires murines de tumeur dans les souris immunocompétentes suivies de MRI est démontrée. L’approche d’injection présentée utilise l’anesthésie isoflurane et une configuration stéréotaxique avec une perceuse et une injection d’aiguilles contrôlées numériquement pour améliorer la précision et réduire les erreurs techniques. L’IRM est mesurée au fil du temps à l’aide d’un instrument de 9,4 Tesla dans l’Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Des mesures de volume de tumeur sont démontrées à chaque point de temps par l’utilisation d’ImageJ. Dans l’ensemble, cette approche d’injection intracrânienne permet une injection précise, une surveillance quotidienne et des mesures précises du volume tumoral, qui, combinées, améliorent considérablement l’utilité de ce système modèle pour tester de nouvelles hypothèses sur les conducteurs de métastases cérébrales.

Introduction

Les métastases cérébrales sont 10 fois plus fréquentes que les tumeurs primaires adultes du système nerveux central¹, et ont été rapportées dans presque tous les types de tumeurs solides avec le cancer du poumon, le cancer du sein et le mélanome présentant l’incidence la plus^{élevée 2}. Indépendamment du site primaire de tumeur, le développement de la métastase de cerveau mène à un pronostic pauvre souvent lié au déclin cognitif, aux maux de tête persistants, aux saisies, aux changements comportementaux et/ou de^{personnalité 1,,3,,4,,5.} En ce qui concerne le cancer du sein, il y a eu de nombreux progrès dans la prévention et le traitement de la maladie. Cependant, 30% de femmes diagnostiquées avec le cancer du sein continuera à développer des métastases, et de ceux avec la maladie de stade IV, approximativement 7% (SEER 2010-2013) ont la métastase de cerveau^6,7. Les options actuelles de traitement pour la métastase cérébrale impliquent la résection chirurgicale, la radiochirurgie stéréotaxique et/ou la radiothérapie entière de cerveau. Pourtant, même avec cette thérapie agressive, la survie médiane pour ces patients est un court 8-11 mois^7,8,9. Ces statistiques sinistres soutiennent fortement la nécessité d’identifier et de mettre en œuvre de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces. Ainsi, comme pour tous les cancers qui métastasent au cerveau, il est essentiel de modéliser correctement les métastases cérébrales associées au cancer du sein (BCBM) en laboratoire afin d’assurer des progrès significatifs dans le domaine.

Jusqu’ici, les chercheurs ont utilisé une série de méthodologies pour étudier des mécanismes de métastase au cerveau, chacun avec des avantages et des limitations^{distincts 10,11.} Les méthodes expérimentales de métastase telles que la veine de queue et l’injection intracardiaque propagent des cellules tumorales dans tout le corps et peuvent avoir comme conséquence la charge immense de tumeur à d’autres emplacements métastatiques selon les cellules injectées. Ces résultats sont alors déroutants si spécifiquement l’étude des métastases au cerveau. La méthode d’injection de l’artère intracarotide est avantageuse car elle cible spécifiquement l’ensemencement du cerveau des cellules tumorales, mais elle est limitée car elle peut être techniquement difficile à effectuer. La résection primaire orthotopique de tumeur est souvent considérée le modèle le plus médicalement pertinent de métastase car elle récapitule la cascade métastatique entière. Pourtant, cette approche implique des périodes d’attente prolongées pour la métastase spontanée à se produire avec des taux considérablement inférieurs de métastase cérébrale par rapport aux autres sites métastatiques tels que le ganglion lymphatique, le poumon et le foie. Souvent, les animaux doivent être retirés des études en raison de la charge tumorale à ces autres sites métastatiques avant le développement de métastases cérébrales. D’autres méthodes impliquant des lignées cellulaires tropicales cérébrales sont efficaces pour métastaser le cerveau; cependant, ces modèles sont limités en ce qu’ils prennent le temps de se développer et perdent souvent leur tropisme avec la propagation. Compte tenu de ces limitations, les chercheurs ont couramment utilisé la méthode d’injection intracrânienne pour modéliser la métastase du cancer^{au cerveau 11,12,13,14} avec différentes^{méthodologies 15,16,17,18,19}. Il est reconnu que cette approche a également des limites, plus important encore en ce qu’elle ne permet pas l’étude des étapes métastatiques tôt comprenant l’intravasation hors de la tumeur primaire, la pénétration par la barrière de cerveau de sang, et l’établissement dans le cerveau. Cependant, il permet aux chercheurs de tester (1) quels facteurs dérivés de tumeurs médient la croissance dans le cerveau (p. ex., manipulation génétique d’un facteur oncogène dans les cellules tumorales), (2) comment les changements dans le microenvironnement métastatique modifient la croissance du cancer à ce site (p. ex., comparaison entre les souris transgéniques avec des composants stromaux modifiés) et (3) l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques sur la croissance des lésions établies.

Compte tenu de l’utilité potentielle du modèle d’injection intracrânienne, il est absolument nécessaire de réduire les erreurs techniques pendant l’injection et de surveiller avec précision la croissance tumorale au fil du temps. La méthode décrite ci-après implique le dosage continu de l’anesthésie inhalée de gaz, et l’implantation directe des cellules de tumeur dans le parenchyme de cerveau utilisant une perceuse stéréotaxique et un support d’injection. L’administration d’anesthésique au gaz permet de peaufiner la profondeur et la durée de l’anesthésie ainsi que d’assurer une récupération rapide et douce. Un système automatisé de forage et d’injection d’aiguilles contrôlé numériquement améliore la précision du site d’injection et réduit les erreurs techniques souvent contractées par les méthodes de forage et d’injection à main libre. L’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) augmente encore la précision dans la surveillance de la croissance tumorale, du volume tumoral, de la réponse tissulaire, de la nécrose tumorale et de la réponse au traitement. L’IRM est la modalité d’imagerie de choix pour les tissus^{mous 20,21}. Cette technique d’imagerie n’utilise pas de rayonnement ionisant et est préférée à la tomographie calculée (Tomodensitométrie), en particulier pour plusieurs séances d’imagerie au cours d’une étude. Mri a une gamme beaucoup plus grande de contraste disponible de tissu mou puis ct ou imagerie par ultrasons (USG) et présente l’anatomie plus en détail. Il est plus sensible et spécifique pour les anomalies dans le cerveau lui-même. L’IRM peut être effectuée dans n’importe quel plan d’imagerie sans avoir à déplacer physiquement le sujet comme c’est le cas dans l’imagerie optique 2D USG ou 2D. Il est important de mentionner que le crâne n’atténue pas le signal IRM comme dans d’autres modalités d’imagerie. L’IRM permet l’évaluation de structures qui peuvent être masquées par des artefacts provenant d’os dans la Tomodensive ou l’USG. Un avantage supplémentaire est qu’il y a beaucoup d’agents de contraste disponibles pour MRI, qui augmente la limite de détection de lésion, avec la toxicité ou les effets secondaires relativement bas. Fait important, l’IRM permet de surveiller en temps réel contrairement à l’évaluation histologique au moment de l’autopsie, qui est limitée dans le déchiffrage du volume tumoral. D’autres modalités d’imagerie, telles que l’imagerie bioluminescente, sont en effet efficaces pour la détection et la surveillance précoces des tumeurs au fil du temps; toutefois, cette méthode exige une manipulation génétique (p. ex., le marquage luciferase/GFP) des lignées cellulaires et ne permet pas de mesures volumétriques. Mri est plus avantageux car il reflète la surveillance patiente et l’analyse volumétrique en aval des images de MR est connue pour être fortement corrélée à la taille histologique de tumeur à^{l’autopsie 22.} La surveillance en série avec le criblage de MRI augmente également la surveillance clinique des affaiblissements neurologiques, si elles se présentent.

Dans l’ensemble, la méthode présentée de l’injection intracrânienne stéréotaxique de tumeur suivie de MRI périodique nous permet de produire des résultats fiables, prévisibles, et mesurables pour étudier des mécanismes de métastase de cerveau dans le cancer.

Protocol

Toutes les méthodes décrites dans le ci-dessous ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protocole #2007A0120). Toutes les politiques d’IACUC de chirurgie de survie de rongeur sont suivies, y compris l’utilisation des techniques stériles, des approvisionnements, des instruments, aussi bien que l’enlèvement de fourrure et la préparation stérile du site d’incision. 1. Injection intracrânienne …

Representative Results

La figure 3 donne une vue d’ensemble de la quantification du volume tumoral d’une seule souris à deux moments (jour 7 et jour 10) après l’injection de cellules tumorales mammaires murines. Pour cette expérience, 50.000 cellules DB7 ont été injectées, et le cerveau de l’animal a été évalué par IRM. Pour chaque scan, 30 tranches (épaisseur de 0,5 mm) ont été capturées. L’évaluation des 30 tranches par balayage a révélé qu’au jour 7 après l’injection, 5 tranches…

Discussion

L’utilisation de l’injection intracrânienne suivie de la surveillance en série avec MRI fournit la capacité unique de visualiser la croissance de tumeur avec la précision de volume de tumeur au fil du temps. L’application de l’analyse numérique d’imagerie permet l’interprétation des lésions cérébrales pour le volume de tumeur, l’hémorragie, la nécrose, et la réponse au traitement.

Comme pour toute procédure, il y a des étapes clés qui doivent être suivies pour ré…

Materials

Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters