Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Summary

A modelagem da metástase cerebral intracraniana é complicada pela incapacidade de monitorar o tamanho do tumor e a resposta ao tratamento com métodos precisos e oportunos. A metodologia apresentada casais injeção de tumor intracraniano com análise de ressonância magnética, que, quando combinada, cultiva injeções precisas e consistentes, monitoramento animal aprimorado e medições precisas de volume de tumor.

Abstract

A disseminação metastática do câncer é uma consequência infeliz da progressão da doença, subtipos agressivos do câncer e/ou diagnóstico tardio. Metástases cerebrais são particularmente devastadoras, difíceis de tratar e conferem um prognóstico ruim. Embora a incidência precisa de metástases cerebrais nos Estados Unidos permaneça difícil de estimar, é provável que aumente à medida que as terapias extracranais continuam a se tornar mais eficazes no tratamento do câncer. Assim, é necessário identificar e desenvolver novas abordagens terapêuticas para tratar a metástase neste local. Para isso, a injeção intracraniana de células cancerosas tornou-se um método bem estabelecido para modelar a metástase cerebral. Anteriormente, a incapacidade de medir diretamente o crescimento do tumor tem sido um empecilho técnico para este modelo; no entanto, o aumento da disponibilidade e da qualidade das pequenas modalidades de imagem animal, como a ressonância magnética (RM), estão melhorando consideravelmente a capacidade de monitorar o crescimento do tumor ao longo do tempo e inferir alterações no cérebro durante o período experimental. Aqui, a injeção intracraniana de células tumorais mamárias de murina em camundongos imunocompetuntes seguidos de ressonância magnética é demonstrada. A abordagem de injeção apresentada utiliza anestesia isoflurane e uma configuração estereotática com uma broca automatizada e injeção de agulha controlada digitalmente para melhorar a precisão e reduzir o erro técnico. A ressonância magnética é medida ao longo do tempo usando um instrumento 9.4 Tesla no Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. As medidas de volume do tumor são demonstradas em cada ponto de tempo através do uso do ImageJ. No geral, essa abordagem de injeção intracraniana permite injeção precisa, monitoramento diário e medições precisas de volume de tumor, que combinaram muito a utilidade deste sistema modelo para testar novas hipóteses sobre os condutores de metástases cerebrais.

Introduction

Metástases cerebrais são 10 vezes mais comuns do que tumores do sistema nervoso central adulto¹, e têm sido relatados em quase todos os tipos de tumores sólidos com câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma apresentando a maior incidência². Independentemente do local do tumor primário, o desenvolvimento da metástase cerebral leva a um prognóstico ruim frequentemente associado ao declínio cognitivo, dores de cabeça persistentes, convulsões, mudanças comportamentais e/ou de personalidade^1,,3,,4,5. Em termos de câncer de mama, houve muitos avanços na prevenção e tratamento da doença. No entanto, 30% das mulheres diagnosticadas com câncer de mama continuarão a desenvolver metástases, e das com doença em estágio IV, aproximadamente 7% (SEER 2010-2013) têm metástase cerebral^6,7. As opções atuais de tratamento para metástase cerebral envolvem ressecção cirúrgica, radiocirurgia estereotática e/ou radioterapia cerebral completa. No entanto, mesmo com essa terapia agressiva, a sobrevida mediana desses pacientes é de 8 a 11 meses^7,8,,9. Essas estatísticas sombrias apoiam fortemente a necessidade de identificação e implementação de novas e eficazes estratégias terapêuticas. Assim, como acontece com todos os cânceres que se metástases no cérebro, é essencial modelar adequadamente a metástase cerebral associada ao câncer de mama (BCBM) em laboratório para garantir avanços significativos no campo.

Até o momento, os pesquisadores utilizaram uma variedade de metodologias para estudar mecanismos de metástase no cérebro, cada uma com distintas vantagens e limitações^10,11. Métodos experimentais de metástase, como veia da cauda e injeção intracardiac, espalham células tumorais por todo o corpo e podem resultar em imensa carga tumoral em outros locais metastáticos, dependendo das células injetadas. Esses resultados são então confundidos se especificamente estudar metástase para o cérebro. O método de injeção da artéria intracarotóide é vantajoso, pois visa especificamente a semeadura cerebral de células tumorais, mas é limitado, pois pode ser tecnicamente difícil de executar. A ressecção do tumor primário ortotópico é frequentemente considerada o modelo mais clinicamente relevante de metástase, pois recapitula toda a cascata metastática. No entanto, essa abordagem envolve períodos de espera prolongados para que a metástase espontânea ocorra com taxas dramaticamente menores de metástase cerebral em comparação com outros locais metastáticos, como o linfonodo, o pulmão e o fígado. Muitas vezes, os animais devem ser removidos de estudos devido à carga tumoral nesses outros locais metastáticos antes do desenvolvimento da metástase cerebral. Outros métodos que envolvem linhas de células trópicos cerebrais são eficazes na metástase do cérebro; no entanto, esses modelos são limitados na forma de que levam tempo para se desenvolver e muitas vezes perdem seu tropismo com a propagação. Diante dessas limitações, os pesquisadores têm usado rotineiramente o método de injeção intracraniana para modelar metástase cancerígena no cérebro^{11,,12,,13,14} com metodologias variadas^{15,,16,,17,,18,,19}. Reconhece-se que essa abordagem tem limitações similares, o mais importante na medida em que não permite a investigação de etapas metastáticas precoces, incluindo a intravasão do tumor primário, a penetração através da barreira cerebral do sangue e o estabelecimento dentro do cérebro. No entanto, permite que os pesquisadores testem (1) quais fatores derivados do tumor mediam o crescimento dentro do cérebro (por exemplo, manipulação genética de um fator oncogênico em células tumorais), (2) como mudanças no microambiente metastático alteram o crescimento do câncer neste local (por exemplo, comparação entre camundongos transgênicos com componentes estrômicos alterados) e (3) eficácia de novas estratégias terapêuticas sobre o crescimento de lesões estabelecidas.

Dada a utilidade potencial do modelo de injeção intracraniana, é absolutamente necessário reduzir o erro técnico durante a injeção e monitorar precisamente o crescimento do tumor ao longo do tempo. O método descrito aqui envolve a dosagem contínua de anestesia de gás inalado, e a implantação direta de células tumorais no parenchyma cerebral usando uma broca estereotática e suporte de injeção. A administração do anestésico a gás permite ajustar a profundidade e o comprimento da anestesia, bem como garantir uma recuperação rápida e suave. Um sistema de injeção de broca e agulha controlado digitalmente aumenta a precisão do local de injeção e reduz o erro técnico frequentemente incorrido por métodos de perfuração e injeção de mão livre. O uso de ressonância magnética (RM) aumenta ainda mais a precisão no monitoramento do crescimento do tumor, volume do tumor, resposta tecidual, necrose tumoral e resposta ao tratamento. A ressonância magnética é a modalidade de imagem escolhida para tecidos moles^20,21. Esta técnica de imagem não usa radiação ionizante e é preferida em relação à Tomografia Computadorizada (TC), especialmente para múltiplas sessões de imagem durante o curso de um estudo. A ressonância magnética tem uma gama muito maior de contraste de tecido mole disponível, em seguida, tomografia computadorizada ou ultrassom (USG) e apresenta anatomia em maior detalhe. É mais sensível e específico para anormalidades dentro do próprio cérebro. A ressonância magnética pode ser realizada em qualquer plano de imagem sem ter que mover fisicamente o sujeito, como é o caso em imagens ópticas 2D USG ou 2D. É importante mencionar que o crânio não atenua o sinal de ressonância magnética como em outras modalidades de imagem. A ressonância magnética permite a avaliação de estruturas que podem ser obscurecidas por artefatos do osso em TC ou USG. Uma vantagem adicional é que existem muitos agentes de contraste disponíveis para ressonância magnética, o que aumenta o limite de detecção de lesões, com toxicidade relativamente baixa ou efeitos colaterais. É importante ressaltar que a ressonância magnética permite o monitoramento em tempo real ao contrário da avaliação histológica no momento da necropsia, que é limitada na decifração do volume do tumor. Outras modalidades de imagem, como a bioluminescente, são de fato eficazes para detecção e monitoramento precoce de tumores ao longo do tempo; no entanto, este método requer manipulação genética (por exemplo, marcação luciferase/GFP) de linhas celulares e não permite medições volumétricas. A ressonância magnética é ainda mais vantajosa, pois espelha o monitoramento do paciente e a análise volumosa das imagens de RM é conhecida por estar fortemente correlacionada com o tamanho do tumor histológico na necropsia²². O monitoramento serial com a triagem de ressonância magnética também aumenta o monitoramento clínico dos prejuízos neurológicos, caso surjam.

No geral, o método apresentado de injeção de tumor intracraniano estereotático seguido de ressonância magnética serial nos permite produzir resultados confiáveis, previsíveis e mensuráveis para estudar mecanismos de metástase cerebral no câncer.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio (P.I. Gina Sizemore; Protocolo #2007A0120). Todas as políticas de cirurgia de sobrevivência de roedores são seguidas, incluindo o uso de técnicas estéreis, suprimentos, instrumentos, bem como remoção de peles e preparação estéril do local da incisão. 1. Injeção intracraniana de células cancerígenas de mama NOT…

Representative Results

A Figura 3 supera a quantificação do volume do tumor para um único rato em dois pontos de tempo (dia 7 e dia 10) pós-injeção de células tumorais mamárias murinas. Para este experimento, 50.000 células DB7 foram injetadas, e o cérebro do animal foi avaliado por ressonância magnética. Para cada varredura, foram capturadas 30 fatias (espessura de 0,5 mm). A avaliação das 30 fatias por exame revelou que no dia 7 pós-injeção, 5 fatias apresentaram carga tumoral<strong class="xfig…

Discussion

A utilização da injeção intracraniana seguida de monitoramento serial com ressonância magnética fornece a capacidade única de visualizar o crescimento do tumor com precisão de volume de tumor ao longo do tempo. A aplicação da análise de imagem digital permite a interpretação das lesões cerebrais para volume de tumor, hemorragia, necrose e resposta ao tratamento.

Como em qualquer procedimento, existem passos-chave que devem ser seguidos para o sucesso. Em primeiro lugar, a configu…

Materials

Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters