Modellering Brain Metastaser gennem intrakraniel injektion og magnetisk resonans Imaging

Summary

Intrakraniel hjerne metastase modellering kompliceres af en manglende evne til at overvåge tumor størrelse og reaktion på behandling med præcise og rettidige metoder. Den præsenterede metode par intrakraniel tumor injektion med magnetisk resonans imaging analyse, som når de kombineres, dyrker præcise og konsekvente injektioner, forbedret dyreovervågning, og præcise tumor volumen målinger.

Abstract

Metastatisk spredning af kræft er en uheldig konsekvens af sygdomsprogression, aggressive kræft undertyper, og / eller sen diagnose. Hjernemetastaser er særligt ødelæggende, vanskelige at behandle, og giver en dårlig prognose. Mens den præcise forekomst af hjernen metastaser i USA er fortsat svært at vurdere, det er sandsynligt, at stige som ekstrakranære behandlinger fortsætte med at blive mere effektiv i behandling af kræft. Det er derfor nødvendigt at identificere og udvikle nye terapeutiske tilgange til behandling af metastase på dette sted. Til dette formål, intrakraniel injektion af kræftceller er blevet en veletableret metode til at modellere hjernen metastase. Tidligere, den manglende evne til direkte at måle tumorvækst har været en teknisk hindring for denne model; men, øge tilgængeligheden og kvaliteten af små dyr billeddannelse modaliteter, såsom magnetisk resonans imaging (MR), er langt bedre evne til at overvåge tumorvækst over tid og udlede ændringer i hjernen i den eksperimentelle periode. Heri, intrakraniel injektion af murine mammary tumorceller i immunkompetente mus efterfulgt af MR-scanning er påvist. Den præsenterede injektion tilgang udnytter isofluran anæstesi og en stereotaktisk setup med en digitalt styret, automatiseret bore- og nåleindsprøjtning for at øge præcisionen og reducere tekniske fejl. MR-scanning måles over tid ved hjælp af en 9,4 Tesla instrument i The Ohio State University James Omfattende Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volumen målinger er demonstreret på hvert tidspunkt gennem brug af ImageJ. Samlet set denne intrakraniel injektion tilgang giver mulighed for præcis injektion, dag-til-dag overvågning, og præcise tumor volumen målinger, som tilsammen i høj grad forbedre nytten af denne model system til at teste nye hypoteser om driverne af hjernen metastaser.

Introduction

Hjernen metastaser er 10 gange mere almindelige end voksne primære centralnervesystemet tumorer^1,og er blevet rapporteret i næsten alle solide tumortype med lungekræft, brystkræft, og melanom udviser den højeste forekomst². Uanset den primære tumor site, udviklingen af hjernen metastase fører til en dårlig prognose ofte forbundet med kognitiv tilbagegang, vedvarende hovedpine, anfald, adfærdsmæssige og / eller personlighedsændringer^1,,3,,4,5. Med hensyn til brystkræft, der har været mange fremskridt i forebyggelse og behandling af sygdommen. Men, 30% af kvinder diagnosticeret med brystkræft vil gå på at udvikle metastaser, og af dem med fase IV sygdom, ca 7% (SEER 2010-2013) har hjernen metastase^6,7. Nuværende behandlingsmuligheder for hjernemetastaser indebærer kirurgisk resektion, stereotaktisk radiokirurgi og/eller hel hjernestrålebehandling. Men selv med denne aggressive behandling, median overlevelse for disse patienter er en kort 8-11 måneder^7,,8,,9. Disse dystre statistikker støtter kraftigt behovet for at identificere og gennemføre nye, effektive terapeutiske strategier. Således, som med alle kræftformer, der metastaserer til hjernen, er det vigtigt at korrekt model brystkræft associeret hjerne metastase (BCBM) i laboratoriet for at sikre betydelige fremskridt på området.

Til dato har forskere udnyttet en række metoder til at studere mekanismer af metastase til hjernen, hver med forskellige fordele og begrænsninger^10,11. Eksperimentelle metastase metoder såsom hale vene og intracardiac injektion sprede tumorceller i hele kroppen og kan resultere i enorme tumor byrde på andre metastatiske steder afhængigt af de injicerede celler. Disse resultater er derefter confounding hvis specifikt studere metastase til hjernen. Den intracarotis arterie injektion metode er fordelagtig, da det specifikt er rettet mod hjerne-såning af tumorceller, men er begrænset, da det kan være teknisk vanskeligt at udføre. Ortopisk primær tumor resektion er ofte betragtes som den mest klinisk relevante model af metastase, da det opsummerer hele metastatisk kaskade. Men denne tilgang indebærer længere ventetider for spontan metastase at forekomme med dramatisk lavere satser for hjernens metastase i forhold til de andre metastatiske steder såsom lymfeknuden, lungen og leveren. Ofte skal dyr fjernes fra undersøgelser på grund af tumor byrde på disse andre metastatiske steder forud for udviklingen af hjerne metastase. Andre metoder, der involverer hjernen tropiske cellelinjer er effektive til metastasering til hjernen; men disse modeller er begrænset i, at de tager tid at udvikle og ofte mister deres tropisme med formering. I betragtning af disse begrænsninger, forskere har rutinemæssigt brugt den intrakranielle injektion metode til model kræft metastase til hjernen^11,12,,13,14 med varierende metoder^{15,16,17,18,19}. Det erkendes, at denne fremgangsmåde ligeledes har begrænsninger, vigtigst af alt i, at det ikke giver mulighed for undersøgelse af tidlige metastatiske skridt, herunder intravasation ud af den primære tumor, penetrans gennem blod-hjerne barrieren, og etablering i hjernen. Men, Det giver mulighed for forskere at teste (1) hvad tumor afledte faktorer mægle vækst i hjernen (f.eks genetisk manipulation af en onkogen faktor i tumorceller), (2) hvordan ændringer i metastatisk mikromiljø ændre kræft vækst på dette sted (f.eks sammenligning mellem transgene mus med ændrede stromale komponenter) og (3) effektiviteten af nye terapeutiske strategier på vækst af etablerede læsioner.

I betragtning af den potentielle nytte af den intrakranielle injektion model, Er det absolut nødvendigt at reducere tekniske fejl under injektion og til præcist at overvåge tumorvækst over tid. Den metode, der er beskrevet heri indebærer kontinuerlig dosering af inhaleret gas anæstesi, og direkte implantation af tumorceller i hjernen parenkym ved hjælp af en stereotaktisk bore- og injektionsstand. Administration af gasbedøvelse giver mulighed for finjustering af dybden og længden af anæstesi samt sikre en hurtig og glat genopretning. Et digitalt styret, automatiseret bore- og nåleindsprøjtningssystem forbedrer injektionsstedets præcision og reducerer tekniske fejl, der ofte opstår ved boring og håndindsprøjtningsmetoder. Brugen af magnetisk resonans imaging (MR) yderligere øger præcisionen i overvågningen tumorvækst, tumor volumen, væv svar, tumor nekrose, og reaktion på behandling. MR er den billeddannende modalitet valg for blødt væv^20,21. Denne billeddannelsesteknik bruger ikke iioniserende stråling og foretrækkes frem for computertomografi (CT), især for flere billedbehandlinger i løbet af en undersøgelse. MR har langt større udvalg af tilgængelige blødt væv kontrast derefter CT eller ultralyd imaging (USG) og præsenterer anatomi i flere detaljer. Det er mere følsom og specifik for abnormiteter i selve hjernen. MR kan udføres i enhver billedbehandling fly uden at skulle fysisk flytte emnet, som det er tilfældet i 2D USG eller 2D optisk billeddannelse. Det er vigtigt at nævne, at kraniet ikke dæmpe MR-signalet som i andre billeddannelse modaliteter. MR tillader evaluering af strukturer, der kan skjules af artefakter fra knogle i CT eller USG. En yderligere fordel er, at der er mange kontrastmidler til rådighed for MR, som øger læsion detektion grænse, med relativt lav toksicitet eller bivirkninger. Vigtigere, MR tillader overvågning i realtid i modsætning til histologisk evaluering på tidspunktet for obduktion, som er begrænset i dechifrere tumor volumen. Andre billeddannelse modaliteter, såsom bioluminescerende billeddannelse, er faktisk effektive til tidlig tumor detektion og overvågning over tid; Denne metode kræver dog genetisk manipulation (f.eks. luciferase/GFP-mærkning) af cellelinjer og giver ikke mulighed for volumetriske målinger. MR er yderligere fordelagtig, da det afspejler patient overvågning og downstream volumetrisk analyse af MR-billeder er kendt for at være stærkt korreleret til histologisk tumor størrelse ved obduktion²². Serieovervågning med MR-screening øger også den kliniske overvågning af neurologiske funktionsnedsættelser, hvis de opstår.

Samlet, den præsenterede metode til stereotokratisk intrakraniel tumor injektion efterfulgt af seriel MR giver os mulighed for at producere pålidelige, forudsigelige, og målbare resultater til at studere mekanismer af hjernen metastase i kræft.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet heri, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på The Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; protokol #2007A0120). Alle gnaver overlevelse kirurgi IACUC politikker følges, herunder brug af sterile teknikker, forsyninger, instrumenter, samt pels fjernelse og steril forberedelse af indsnit site. 1. Intrakraniel injektion af brystkræftceller BEMÆRK: Den metode, der er beskrevet heri udnyttet DB7 muri…

Representative Results

Figur 3 oversigter tumor volumen kvantificering for en enkelt mus på to tidspunkter (dag 7 og dag 10) post-injektion af murine mammary tumorceller. Til dette eksperiment blev 50.000 DB7-celler injiceret, og dyrets hjerne blev evalueret af MR. For hver scanning blev der fanget 30 skiver (0,5 mm tykkelse). Evaluering af de 30 skiver pr scanning viste, at på dag 7 efter injektion, 5 skiver udstillet tumor byrde (Figur 3A) og på dag 10 efter injektion, 9 skiver u…

Discussion

Udnyttelsen af intrakraniel injektion efterfulgt af seriel overvågning med MR giver den unikke evne til at visualisere tumorvækst med tumorvolumen nøjagtighed over tid. Anvendelsen af digital billeddannelse analyse giver mulighed for fortolkning af hjernelæsioner for tumor volumen, blødning, nekrose, og reaktion på behandling.

Som med enhver procedure, er der vigtige skridt, der skal følges for succes. For det første er omhyggelig opsætning af stereotaktiske enheder afgørende for den…

Materials

Surgical Materials
Betadine	Purdue Products	19-027132	Povidone-iodine, 7.5%
Bone Wax	Surgical Specialities	903	Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation
Cotton tip applicators	Puritan	25-806 10WC	Sterile long stemmed cotton tip applicators
Eye Ointment	Puralube	17033-211-38	Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment
Handwarmers	Hothands	HH2	Air-activated heat packs
Ibuprofen	Up & Up	094-01-0245	100mg per 5mL in liquid suspension
Isoflurane	Henry Schein INC	1182097	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
Scalpels	Integra Miltex	4-410	#10 disposable scalpel blade
Skin Glue	Vetbond	1469SB	Skin safe wounds adhesive
Sterile Dressing	TIDI Products	25-517	Individually packed sterile drapes
Suture	Covidien	SP5686G	45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)	Kopf	Model 1474	Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B	Mouth bar with teeth hole and nosecone
Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 922	Ear bars suitable for mouse applications
Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 940	Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor
Injector
Injector Needle and syringe	Hamilton	80366	26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe
Legato 130A automated Syringe Pump	KD Scientific	P/N: 788130	Programmable touch screen base with automated injector
Anesthesia Machine
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific	SS-01	Digital anesthesia machine
SomnoSuite Starter Kit for mice	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters