Presenteras här är ett protokoll för Pseudomonas aeruginosa infektion och terapi ansökan i cystisk fibros (CF) zebrafisk embryon.
Antimikrobiell resistens, en stor följd av diagnostisk osäkerhet och antimikrobiell överprescription, är en alltmer erkänd orsak till allvarliga infektioner, komplikationer och dödlighet över hela världen med en enorm inverkan på vårt samhälle och på hälso-och sjukvårdssystemet. I synnerhet patienter med nedsatt immunförsvar eller redan existerande och kroniska patologier, såsom cystisk fibros (CF), utsätts för täta antibiotika behandlingar för att kontrollera infektioner med utseende och diffusion av multidrug resistenta isolat. Därför finns det ett akut behov av att ta itu med alternativa terapier för att motverka bakteriella infektioner. Användning av bakteriofafer, bakteriernas naturliga fiender, kan vara en möjlig lösning. Protokollet som beskrivs i detta arbete beskriver tillämpningen av terapi mot Pseudomonas aeruginosa infektion i CF zebrafish embryon. Zebrafish embryon var infekterade med P. aeruginosa att visa att terapi är effektivt mot P. aeruginosa infektioner eftersom det minskar dödlighet, bakteriell börda och pro-inflammatoriska immunsvar i CF embryon.
Fagen terapi, användningen av naturliga fiender av bakterier för att bekämpa bakteriella infektioner, är garnering förnyat intresse som bakteriell resistens mot antibiotika blir utbredd1,2. Denna terapi, som används i årtionden i Östeuropa, kan betraktas som en kompletterande behandling till antibiotika i bota lunginfektioner hos patienter med CF och ett möjligt terapeutiskt alternativ för patienter infekterade med bakterier som är resistenta mot alla de närvarande i bruk antibiotika2,3. Fördelar med antibiotikabehandling är att bakteriofakom förökar sig på infektionsstället, medan antibiotika metaboliseras och elimineras från kroppen4,5. Faktum är att administrationen av cocktails av virulenta fager isolerade i olika laboratorier har visat sig vara effektiva vid behandling av Pseudomonas aeruginosa infektioner i djurmodeller så olika som insekter och däggdjur6,7,8. terapi visade sig också kunna minska bakteriebördan i brännsår infekterade med P. aeruginosa och Escherichia coli i en randomiserad klinisk prövning9.
Zebrafisk (Danio rerio) har nyligen framträtt som en värdefull modell för att studera infektioner med flera patogener, inklusive P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus och Burkolderia cepacia12,13. Genom att mikroinjicita bakterier direkt i embryotblodcirkulationen 14 är det lätt att etablera en systemisk infektion som motverkas av zebrafisken medfödda immunsystemet, som är evolutionärt bevarat med neutrofiler och makrofaggenerering som liknar den mänskliga motsvarigheten. Dessutom, under den första månaden av livet, zebrafish embryon saknar adaptiv immunsvar, vilket gör dem idealiska modeller för att studera den medfödda immunitet, som är den kritiska försvarsmekanismen i mänskliga lunginfektioner15. Zebrafish uppstod nyligen som ett kraftfullt genetisk modellsystem för att bättre förstå CF-instävlet och för att utveckla nya farmakologiska behandlingar10,16,17. CF-zebrafiskmodellen av CFTR knock-down genererad med morfolininjektion i zebrafisk presenterade ett dämpat andningssprängningssvar och minskad neutrofil migration10, medan cftr knock-out leder till försämrad inre organposition och förstörelsen av den exokrina bukspottkörteln, en fenotyp som speglar människans sjukdom16,17. Av största intresse var konstaterandet att P. aeruginosa bakteriebörda var betydligt högre i cftr-förlust-of-funktion embryon än i kontroller vid 8 timmar efter infektion (hpi), som paralleller de resultat som erhållits med möss och mänskliga bronkial epitelceller2,18.
I detta arbete visar vi att terapi är effektivt mot P. aeruginosa infektioner i zebrafish embryon.
I detta manuskript beskrev vi protokollet att utföra P. aeruginosa (PAO1) infektion i zebrafish embryon och hur man tillämpa terapi med en cocktail av fager som tidigare identifierats som kan infektera PAO1 att lösa det. Användningen av bakteriofafer som ett alternativ till antibiotikabehandlingar har varit av allt större intresse sedan de senaste åren. Detta beror främst på att multiresistenta (MDR) bakterieinfektioner sprids, som utgör en allvarlig fråga för folkhälsan. Naturligtvis är omfattninge…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den italienska cystisk fibros Foundation (FFC# 22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo och FFC#23/2019; Un respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Stereomicroscope | Leica | S9I | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |