Billeddannelse og analyse af olierøde O-farvede hele Aorta-læsioner i en aneurismehyperlipidæmi-musemodel
Summary
Denne protokol giver en trinvis procedure til analyse af aterosklerotisk byrde hos mus. Efterforskere kan bruge denne protokol til at sammenligne overflod, placering og størrelse af aterosklerotiske læsioner hos forskellige dyr.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- eller lipoproteinreceptor med lav densitet (Ldlr)-mangelfulde hyperlipidæmiske mus er de to mest anvendte modeller til ateroskleroseforskning. De bruges til at studere virkningen af forskellige genetiske faktorer og forskellige celletyper på aterosklerotisk læsionsdannelse og samt teste udviklingen af nye terapier. Isolering, udskæring af hele aorta og kvantificering af olierød o-farvede aterosklerotiske læsioner er grundlæggende morfometriske metoder, der anvendes til at evaluere aterosklerotisk byrde. Målet med denne protokol er at beskrive en optimeret, trin-for-trin kirurgisk metode til at dissekere, perfuse-fixe, isolere, plette, afbilde og analysere aterosklerotiske læsioner i museaortas med OlieRød O. Fordi atherosklerotiske læsioner kan dannes hvor som helst i hele aortatræet, har hele denne aorta Oil Red O-farvningsmetode fordelen ved at evaluere lipidbelastede plaques i hele aorta og alle grene i en enkelt mus. Ud over Oil Red O-farvning kan friske isolerede hele aortas bruges til forskellige in vitro- og in vivo-eksperimenter og celleisoleringer.
Introduction
Koronararteriesygdom, en førende årsag til dødelighed i USA, er normalt forårsaget af aterosklerose, en proces, der fører til opbygning af plak inde i arterielle vægge1. Hyperlipidæmi-tilbøjelige Apoe- og Ldlr-mangelfulde mus er centrale for undersøgelser af aterosklerose og dens komplikationer og udvikling af terapier2,3,4,5. Kvantificering af aterosklerotiske læsioner fra en en face aorta er en vigtig endepunktsanalyse til evaluering af virkningen af genetisk manipulation i forskellige celletyper. Det hjælper også med at studere nye terapier designet til at påvirke initiering af aterosklerotisk sygdom, progression og regression. Aterosklerotiske læsioner kan dannes hvor som helst i aorta og dets grene (dvs. brachiocephalic, carotis og subclavian arterier i brystet samt nyre,almindelig iliac og lårbensarterier under membranen)6. En omfattende evaluering af åreforkalkningsbyrden og passende behandling kræver vurdering af sygdomsbyrden forskellige steder, en udfordring, der ofte overses.
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en omfattende analyse af aterosklerotiske læsioner, der starter med en uåbnet hel aorta og fortsætter til en ansigtsforberedelse i en enkelt mus. Uåbnet hel aorta Oil Red O-farvning muliggør hurtig, kvalitativ vurdering af lipidbelastede plaques i hele aorta og dens grene, mens en ansigtsforberedelse giver en kvantitativ vurdering af aterosklerotisk læsionsfordeling i musens aorta.
Teknikken bruger 8 uger gamle mus med en glat muskelcellespecifik TGFβR2-deletion på apoe-/- hyperlipidæmisk baggrund (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; i det følgende benævnt TGFβR2iSMC-Apoe-mus) og kuldmat Apoe-/- kontroller (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; i det følgende benævnt Apoe-/- mus). Dyrene holdes i 16 uger på en fedtrig kost med højt kolesteroltal (HCHFD) som undersøgelsesmateriale7. Ved undersøgelsens afslutning farves og afbildes de uåbnede hele aortaer (inklusive alle større grene) med Olierød O til kvalitativ vurdering af lipidbelastede plaques. Aortaerne skæres op via en ansigtsforberedelse, og alle aterosklerotiske læsioner afbildes og kvantificeres. Denne protokol kan bruges til at studere aterosklerotisk læsionsudvikling i Apoe-/- eller Ldlr-/- hyperlipidæmimusmodeller og udvides til generelle aorta-relaterede vaskulære biologiske anvendelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) og lipoproteinreceptor med lav densitet (Ldlr) mangelfulde mus er nyttige til at studere udvikling og behandling af aterosklerose. Efterforskere kan evaluere virkningen af genetik og terapeutiske manipulationer på aterosklerose-relaterede sygdomme initiering, progression og regression ved hjælp af Oil Red O farvning af hele aorta9. Aorta Oil Red O farvning og læsionskvantificering er guldstandardendepunktet for ateroskleroseforskning. Denne teknik er bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af et Joint Biology Consortium Microgrant ydet under NIH-tilskud P30AR070253 (P.-Y.C.) og HL135582 (M.S.). Vi er taknemmelige for R. Webber og L. Coon for at opretholde de mus, der blev brugt i denne undersøgelse.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
