Avbildning og analyse av oljerød o-farget hel aorta lesjoner i en aneurisme hyperlipidemi mus modell
Summary
Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å analysere aterosklerotisk byrde hos mus. Etterforskere kan bruke denne protokollen til å sammenligne overflod, plassering og størrelse på aterosklerotiske lesjoner hos forskjellige dyr.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- eller lipoproteinreseptor med lav tetthet (Ldlr)-mangelfulle hyperlipidemiske mus er de to mest brukte modellene for ateroskleroseforskning. De brukes til å studere effekten av en rekke genetiske faktorer og forskjellige celletyper på aterosklerotisk lesjonsdannelse og samt teste utviklingen av nye terapier. Isolasjon, eksisjon av hele aorta og kvantifisering av oljerød O-farget aterosklerotiske lesjoner er grunnleggende morfometriske metoder som brukes til å evaluere aterosklerotisk byrde. Målet med denne protokollen er å beskrive en optimalisert, trinnvis kirurgisk metode for å dissekere, parfyme-fikse, isolere, flekke, bilde og analysere aterosklerotiske lesjoner i museortas med oljerød O. Fordi aterosklerotiske lesjoner kan dannes hvor som helst i hele aortatreet, har hele aorta Oil Red O-fargingsmetoden fordelen av å evaluere lipidbelastede plakk i hele aorta og alle grener i en enkelt mus. I tillegg til oljerød O-farging kan friske isolerte hele aortas brukes til en rekke in vitro- og in vivo-eksperimenter og celleisolasjoner.
Introduction
Koronararteriesykdom, en ledende årsak til dødelighet i USA, er vanligvis forårsaket av aterosklerose, en prosess som fører til oppbygging av plakk inne i arterielle vegger1. Hyperlipidemi-utsatte Apoe- og Ldlr-mangelfulle mus er sentrale for undersøkelser av aterosklerose og dens komplikasjoner og utvikling av terapier2,3,4,5. Kvantifisering av aterosklerotiske lesjoner fra en en face aorta er en viktig endepunktanalyse for å evaluere effekten av genetisk manipulasjon i forskjellige celletyper. Det bidrar også til å studere nye terapier designet for å påvirke aterosklerotisk sykdomsinitiering, progresjon og regresjon. Aterosklerotiske lesjoner kan dannes hvor som helst i aorta og dens grener (dvs. brachiocephalic, karotis og subklavisiske arterier i brystet, samt nyre-, vanlige iliac- og lårarterier under membranen)6. En omfattende evaluering av aterosklerosebyrde og hensiktsmessig terapi krever vurdering av sykdomsbyrde på forskjellige steder, en utfordring som ofte overses.
Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en omfattende analyse av aterosklerotiske lesjoner, starter med en uåpnet hel aorta og fortsetter å en ansiktsforberedelse, i en enkelt mus. Uåpnet hel aorta olje rød O farging tillater rask, kvalitativ vurdering av lipid-ladede plakk i hele aorta og dens grener, mens en ansiktsforberedelse gir en kvantitativ vurdering av aterosklerotisk lesjonsfordeling i musen aorta.
Teknikken bruker 8 uker gamle mus med en jevn muskelcellespesifikk TGFβR2-sletting på Apoe-/- hyperlipidemisk bakgrunn (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; heretter referert til som TGFβR2iSMC-Apoe mus) og kull apoe-/- kontroller (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; heretter referert til som Apoe-/- mus). Dyrene holdes i 16 uker på et høyt kolesterol høyt fett diett (HCHFD) som studiematerialer7. Ved studieavslutning blir de uåpnede hele aortaene farget og avbildet (inkludert alle større grener) med Oljerød O for kvalitativ vurdering av lipidbelastede plakk. Aortaene er kuttet åpne via en ansiktsforberedelse, og alle aterosklerotiske lesjoner er avbildet og kvantifisert. Denne protokollen kan brukes til å studere aterosklerotisk lesjonsutvikling i Apoe-/- eller Ldlr-/- hyperlipidemimusmodeller og utvidet til generelle aortarelaterte vaskulære biologiapplikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) og lipoproteinreseptor med lav tetthet (Ldlr) mangelfulle mus er nyttige for å studere utvikling og behandling av aterosklerose. Etterforskere kan evaluere effekten av genetikk og terapeutiske manipulasjoner på ateroskleroserelaterte sykdommer initiering, progresjon og regresjon ved hjelp av Oljerød O farging av hele aorta9. Aorta Oil Red O farging og lesjon kvantifisering er gull standard endepunkt for aterosklerose forskning. Denne teknikken er billig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av et Joint Biology Consortium Microgrant levert under NIH grant P30AR070253 (P.-Y.C.) og HL135582 (M.S.). Vi er takknemlige til R. Webber og L. Coon for å opprettholde musene som brukes i denne studien.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
