Imagem e Análise de Lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma
Summary
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para analisar a carga aterosclerótica em camundongos. Os investigadores podem usar este protocolo para comparar a abundância, localização e tamanho das lesões ateroscleróticas em diferentes animais.
Abstract
Apolipoproteína E (Apoe)- ou receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr)-camundongos hiperlipidêmicos deficientes são os dois modelos mais usados para pesquisa de aterosclerose. Eles são usados para estudar o impacto de vários fatores genéticos e diferentes tipos de células na formação de lesões ateroscleróticas e também testar o desenvolvimento de novas terapias. Isolamento, excisão de toda a aorta e quantificação de lesões ateroscleróticas manchadas de óleo são métodos morfométricos básicos utilizados para avaliar a carga aterosclerótica. O objetivo deste protocolo é descrever um método cirúrgico otimizado, passo a passo para dissecar, perfuse-fix, isolar, manchar, imagem e analisar lesões ateroscleróticas em aortas de camundongos com O Vermelho Óleo. Como lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar em toda a árvore aórtica, todo este método de coloração de aorta- vermelha orta tem a vantagem de avaliar placas carregadas de lipídios em toda a aorta e todos os ramos em um único rato. Além da coloração de Óleo Vermelho O, aortas inteiras isoladas frescas podem ser usadas para variedade de experimentos in vitro e in vivo e isolamentos celulares.
Introduction
A doença arterial coronariana, uma das principais causas de mortalidade nos EUA, é geralmente causada pela aterosclerose, um processo que leva ao acúmulo de placa dentro de paredes arteriais1. Camundongos deficientes de hiperlipidemia e ldlr são centrais para as investigações de aterosclerose e suas complicações e desenvolvimento de terapias2,3,4,5. A quantificação de lesões ateroscleróticas a partir de uma aorta en face é uma importante análise de ponto final para avaliar o impacto da manipulação genética em diferentes tipos de células. Também ajuda a estudar novas terapias projetadas para afetar a iniciação, progressão e regressão da doença aterosclerótica. Lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar da aorta e seus ramos (ou seja, braquiocefálicas, carótidas e subclávias no peito, bem como artérias renais, ilíacas comuns e femorais abaixo do diafragma)6. Uma avaliação abrangente da carga de aterosclerose e da terapia adequada requer a avaliação da carga da doença em diferentes locais, um desafio que muitas vezes é negligenciado.
Este protocolo descreve como realizar uma análise abrangente das lesões ateroscleróticas, começando com uma aorta inteira não aberta e procedendo para en preparação facial, em um único rato. A coloração inteira de aorta vermelha o óleo não aberto permite uma avaliação rápida e qualitativa de placas carregadas de lipídios em toda a aorta e seus ramos, enquanto a preparação facial fornece uma avaliação quantitativa da distribuição da lesão aterosclerótica na aorta do rato.
A técnica utiliza camundongos de 8 semanas com uma exclusão TGFβR2 específica para células musculares lisas no fundo apoe/- hiperlipidêmico (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe/-; a partir de agora referido como ratos TGFβR2iSMC-Apoe) e controles de amuleto Apoe-/- (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe/-; a partir de agora referido como Apoe-/- ratos). Os animais são mantidos por 16 semanas em uma dieta rica em colesterol alto (HCHFD) como materiais de estudo7. No término do estudo, as aortas inteiras não abertas são manchadas e imagens (incluindo todos os principais ramos) com O Vermelho Óleo para avaliação qualitativa de placas carregadas de lipídios. As aortas são cortadas através da preparação do rosto, e todas as lesões ateroscleróticas são imagens e quantificadas. Este protocolo pode ser usado para estudar o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas nos modelos de camundongos de hiperlipidemia apoe/ou Ldlr/- hiperlipidemia e estendido a aplicações gerais de biologia vascular relacionadas à aorta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoproteína E (Apoe) e os camundongos deficientes do receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr) são úteis para estudar o desenvolvimento e o tratamento da aterosclerose. Os pesquisadores podem avaliar o impacto da genética e manipulações terapêuticas na iniciação, progressão e regressão de doenças relacionadas à aterosclerose, progressão e regressão usando a coloração de Óleo Vermelho O de toda a aorta9. A coloração de O vermelho e a quantificaç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado, em parte, por um Consórcio Conjunto de Biologia Microgrant fornecido sob a concessão do NIH P30AR070253 (P.-Y.C.), e HL135582 (M.S.). Somos gratos a R. Webber e L. Coon por manter os ratos usados neste estudo.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
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