Визуализация и анализ поражений всей аорты с масляным красным O-окрашиванием в мышиной модели гиперлипидемии аневризмы
Summary
Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру анализа атеросклеротической нагрузки у мышей. Исследователи могут использовать этот протокол для сравнения обилия, местоположения и размера атеросклеротических поражений у разных животных.
Abstract
Аполипопротеин Е (Apoe) – или низкоплотные липопротеиновые рецепторы (Ldlr) – гиперлипидемические мыши являются двумя наиболее часто используемыми моделями для исследований атеросклероза. Они используются для изучения влияния различных генетических факторов и различных типов клеток на формирование атеросклеротического поражения, а также для проверки разработки новых методов лечения. Выделение, иссечение всей аорты и количественная оценка атеросклеротических поражений, окрашенных Oil Red O, являются основными морфометрическими методами, используемыми для оценки атеросклеротической нагрузки. Целью этого протокола является описание оптимизированного, пошагового хирургического метода рассечения, перфьюзирования-фиксации, выделения, окрашивания, изображения и анализа атеросклеротических поражений у аорты мышей с Oil Red O. Поскольку атеросклеротические поражения могут образовываться в любом месте всего дерева аорты, этот метод окрашивания всей аорты Oil Red O имеет преимущество оценки липидных бляшек во всей аорте и всех ветвях у одной мыши. В дополнение к окрашиванию Oil Red O, свежеизолированная цельная аорта может быть использована для различных экспериментов in vitro и in vivo и изоляции клеток.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца, ведущая причина смертности в США, обычно вызвана атеросклерозом, процессом, который приводит к накоплению бляшек внутри артериальных стенок1. Склонные к гиперлипидемии мыши с дефицитом apoe- и Ldlr занимают центральное место в исследованиях атеросклероза и его осложнений и разработке методов лечения2,3,4,5. Количественная оценка атеросклеротических поражений от аорты лица является важным анализом конечных точек для оценки влияния генетических манипуляций на различные типы клеток. Это также помогает изучать новые методы лечения, предназначенные для воздействия на инициацию, прогрессирование и регрессию атеросклеротического заболевания. Атеросклеротические поражения могут образовываться в любом месте аорты и ее ветвей (т.е. брахиоцефальных, сонных и подключичных артерий в грудной клетке, а также почечных, общих подвздошных и бедренных артерий ниже диафрагмы)6. Всесторонняя оценка бремени атеросклероза и соответствующая терапия требуют оценки бремени болезней в разных местах, что часто упускается из виду.
Этот протокол описывает, как выполнить комплексный анализ атеросклеротических поражений, начиная с нераскрытой всей аорты и заканчивая подготовкой лица, на одной мыши. Неоткрытое окрашивание всей аорты Oil Red O позволяет быстро и качественно оценить липидные бляшки во всей аорте и ее ветвях, а подготовка лица обеспечивает количественную оценку распространения атеросклеротического поражения в аорте мыши.
Метод использует 8-недельных мышей с гладкомышечной клеточной специфической делецией TGFβR2 на гиперлипидемическом фоне Apoe-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Апоэ-/-; далее именуемые TGFβR2iSMC-Apoe mice) и пометные apoe-/- контрольные элементы (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Апоэ-/-; далее именуемые обезьянами Apoe-/-mice). Животные содержатся в течение 16 недель на диете с высоким содержанием холестерина и высоким содержанием жиров (ГХГФД) в качестве материалов исследования7. В конце исследования неоткрытые целые аорты окрашиваются и визуализируются (включая все основные ветви) Oil Red O для качественной оценки липидных бляшек. Аорта разрезается с помощью препарата для лица, и все атеросклеротические поражения визуализируются и количественно оцениваются. Этот протокол может быть использован для изучения развития атеросклеротического поражения в моделях мышей с гиперлипидемией Apoe-/- или Ldlr-/- и распространен на общие приложения сосудистой биологии, связанные с аортой.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мыши с дефицитом аполипопротеина Е (Apoe) и рецептора липопротеинов низкой плотности (Ldlr) полезны для изучения развития и лечения атеросклероза. Исследователи могут оценить влияние генетики и терапевтических манипуляций на начало, прогрессирование и регрессию заболеваний, свя…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана, в частности, микрогрантом Объединенного биологического консорциума, предоставленным в рамках гранта NIH P30AR070253 (P.-Y.C.) и HL135582 (M.S.). Мы благодарны Р. Уэбберу и Л. Куну за содержание мышей, использованных в этом исследовании.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
