Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse
Summary
Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.
Abstract
Sympathische neuronen van de embryonale rat superieure cervicale ganglia (SCG) zijn gebruikt als een in vitro model systeem voor perifere neuronen om axonale groei, axonale handel, synaptogenese, dendritische groei, dendritische plasticiteit en zenuw-doel interacties in co-cultuur systemen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de isolatie en dissociatie van neuronen van de superieure cervicale ganglia van E21 rat embryo’s, gevolgd door de voorbereiding en het onderhoud van zuivere neuronale culturen in serum-vrij medium. Aangezien neuronen zich niet houden aan ongecoat plastic, neuronen zullen worden gekweekt op 12 mm glazen coverslips of 6-well platen bekleed met poly-D-lysine. Na behandeling met een antimitotisch middel (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), genereert dit protocol gezonde neuronale culturen met minder dan 5% niet-neuronale cellen, die meer dan een maand in vitro kunnen worden gehandhaafd. Hoewel embryonale rat SCG neuronen multipolair zijn met 5-8 dendrieten in vivo; onder serumvrije omstandigheden breiden deze neuronen slechts één axon in de cultuur uit en blijven unipolair voor de duur van de cultuur. Echter, deze neuronen kunnen worden geïnduceerd om dendrieten uit te breiden in de aanwezigheid van kelder membraan extract, bot morfogenetische eiwitten (BMPs), of 10% foetale kalf serum. Deze homogene neuronale culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemische kleuring en voor biochemische studies. Dit artikel beschrijft ook geoptimaliseerd protocol voor immunocytochemische kleuring voor microtubuli geassocieerde eiwit-2 (MAP-2) in deze neuronen en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrie.
Introduction
Sympathische neuronen afgeleid van embryonale superieure cervicale ganglia (SCG) zijn op grote schaal gebruikt als een primaire neuronale cultuur systeem voor het bestuderen van vele aspecten van de neuronale ontwikkeling, waaronder groeifactor afhankelijkheid, neuron-target interacties, neurotransmitter signalering, axonale groei, dendriet ontwikkeling en plasticiteit, synaptogenese en signalering mechanismen die ten grondslag liggen aan nerve-target / neuron-glia interacties1,2,3,,4,5,6,7,8,9. Ondanks hun kleine omvang (ongeveer 10000 neuronen / ganglia), zijn er drie belangrijke redenen voor de ontwikkeling en uitgebreid gebruik van dit cultuursysteem zijn i) zijn de eerste ganglia in de sympathieke keten, ze zijn groter, en dus gemakkelijker te isoleren, dan de rest van de sympathieke ganglia10; ii) in tegenstelling tot centrale neuronen, de neuronen in de SCG zijn vrij homogeen met alle neuronen worden afgeleid van de neurale kam, met een vergelijkbare grootte, afhankelijkheid van zenuwgroei factor en wordt noch-adrenerge. Dit maakt ze een waardevol model voor morfologische en genomische studies10,11 en iii) deze neuronen kunnen worden gehandhaafd in een gedefinieerd serum-vrij medium met zenuwgroeifactor voor meer dan een maand10,12. Perinatale SCG neuronen zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de initiatie en het onderhoud van dendrieten2. Dit komt vooral omdat, hoewel SCG neuronen hebben een uitgebreide dendritische prieel in vivo, ze niet uit te breiden denndrites in vitro in de afwezigheid van serum, maar kan worden geïnduceerd om denndrites groeien in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren zoals bot morfogenetische eiwitten2,12,13.
Dit artikel beschrijft het protocol voor het isoleren en kweken van embryonale rat SCG neuronen. In de afgelopen 50 jaar zijn primaire neuronale culturen van de SCG voornamelijk gebruikt voor morfologische studies met een beperkt aantal studies die de grootschalige genomische of proteomische veranderingen onderzoeken. Dit is voornamelijk te wijten aan kleine weefselgrootte resulterend in de isolatie van lage hoeveelheden DNA of eiwit, waardoor het moeilijk is om genomische en proteomische analyses uit te voeren op deze neuronen. In de afgelopen jaren heeft de toegenomen detectiegevoeligheid echter de ontwikkeling van methoden mogelijk gemaakt om het genoom, miRNome en proteoom in de SCG-neuronen te onderzoeken tijdens de dendritische groeiontwikkeling14,15,16,17. Dit document zal ook de methode beschrijven voor morfologische analyse van deze neuronen met behulp van immunocytochemie en een protocol om neuronale eiwitextracten te verkrijgen voor massaspectrometrische analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de protocollen voor het kweken van sympathische neuronen van superieure cervicale ganglia van embryonale rattenpups. De voordelen van het gebruik van dit model systeem zijn dat het mogelijk is om een homogene populatie van neuronen die een vergelijkbare reactie op groeifactoren te verkrijgen, en aangezien de groeifactor eisen voor deze neuronen is goed gekarakteriseerd, is het mogelijk om deze neuronen groeien in vitro in gedefinieerde media, onder serum-vrije omstandigheden10</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Faculty Development Fund en Summer Research Program subsidie aan Saint Mary’s College of California. De auteurs willen ook dr. Pamela Lein aan de Universiteit van Californië in Davis en Dr. Anthony Iavarone aan de UC Berkeley Mass spectrometrie faciliteit bedanken voor hun advies tijdens de ontwikkeling van deze protocollen. De auteurs willen haley Nelson ook bedanken in het Office of College Communications aan het Saint Mary’s College of California voor haar hulp bij videoproductie en -bewerking.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. 발생학. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. 발생학. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
