Culturing Rat Sympathische Neuronen aus embryonalen überlegenen Cervical Ganglia für morphologische und proteomische Analyse
Summary
Dieses Papier beschreibt die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten sympathischen Neuronen aus den überlegenen zervikalen Ganglien. Es bietet auch detaillierte Protokolle für immunzytochemische Färbung und für die Vorbereitung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie-Analyse.
Abstract
Sympathische Neuronen aus der embryonalen Ratte überlegene Zervixganglien (SCG) wurden als In-vitro-Modellsystem für periphere Neuronen verwendet, um axonales Wachstum, Axonalhandel, Synaptogenese, dendritisches Wachstum, dendritische Plastizität und Nerven-Ziel-Wechselwirkungen in Co-Kultur-Systemen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Dissoziation von Neuronen von den überlegenen zervikalen Ganglien von E21-Rattenembryonen, gefolgt von der Herstellung und Aufrechterhaltung reiner neuronaler Kulturen im serumfreien Medium. Da Neuronen nicht an unbeschichtetem Kunststoff haften, werden Neuronen entweder auf 12 mm Glasabdeckungen oder 6-Well-Platten mit Poly-D-Lysin beschichtet kultiviert. Nach der Behandlung mit einem antimitatischen Mittel (Ara-C, Cytosin-D-Arabinofuranosid) erzeugt dieses Protokoll gesunde neuronale Kulturen mit weniger als 5% nicht-neuronalen Zellen, die über einen Monat in vitro aufrechterhalten werden können. Obwohl embryonale Ratten-SCG-Neuronen multipolar mit 5-8 Dendriten in vivo sind; unter serumfreien Bedingungen dehnen sich diese Neuronen nur ein einziges Axon in der Kultur aus und sind für die Dauer der Kultur weiterhin unipolar. Jedoch, Diese Neuronen können induziert werden, um Dendriten in Gegenwart von Kellermembran-Extrakt, Knochen morphogenetische Proteine (BMPs) oder 10% fetales Kalbsserum zu erweitern. Diese homogenen neuronalen Kulturen können für immunzytochemische Färbung und für biochemische Studien verwendet werden. In diesem Beitrag wird auch das optimierte Protokoll für die immunzytochemische Färbung für Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2 (MAP-2) in diesen Neuronen und für die Herstellung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie beschrieben.
Introduction
Sympathische Neuronen, die aus embryonalen überlegenen Halsbandlien (SCG) abgeleitet wurden, wurden weithin als primäres neuronales Kultursystem für die Untersuchung vieler Aspekte der neuronalen Entwicklung verwendet, einschließlich Wachstumsfaktorabhängigkeit, Neuron-Ziel-Interaktionen, Neurotransmitter-Signalisierung, Axonalwachstum, Dendritenentwicklung und Plastizität, Synaptogenese und Signalmechanismen, die Nervenziel-/Neuron-Glia-Wechselwirkungen zugrunde liegen1,2,3,4,5,,,6 ,7,9,9 ,. Trotz ihrer geringen Größe (ca. 10000 Neuronen/Ganglien) gibt es drei Hauptgründe für die Entwicklung und den umfassenden Einsatz dieses Kultursystems sind i) die ersten Ganglien in der sympathischen Kette, sie sind größer und daher leichter zu isolieren, als der Rest der sympathischen Ganglien10; ii) Im Gegensatz zu zentralen Neuronen sind die Neuronen im SCG ziemlich homogen, wobei alle Neuronen aus dem neuralen Kamm abgeleitet sind, eine ähnliche Größe haben, vom Nervenwachstumsfaktor abhängig sind und nor-adrenergen sind. Dies macht sie zu einem wertvollen Modell für morphologische und genomische Studien10,11 und iii) diese Neuronen können in einem definierten serumfreien Medium gehalten werden, das Nervenwachstumsfaktor für mehr als einen Monat10,12enthält. Perinatale SCG-Neuronen wurden ausgiebig für die Untersuchung der Mechanismen verwendet, die der Initiierung und Wartung von Dendriten zugrunde liegen2. Dies liegt vor allem daran, dass SCG-Neuronen zwar eine ausgedehnte dendritische Laube in vivo haben, aber sie nicht in vitro in Abwesenheit von Serum ausdehnen, sondern in Gegenwart bestimmter Wachstumsfaktoren wie Knochenmorphogenetische Proteine2,12,13zum Anbau von Dendriten induziert werden können.
Dieses Papier beschreibt das Protokoll zur Isolierung und Kultivierung embryonaler Ratten-SCG-Neuronen. In den letzten 50 Jahren wurden primäre neuronale Kulturen aus dem SCG hauptsächlich für morphologische Studien verwendet, wobei eine begrenzte Anzahl von Studien die groß angelegten genomischen oder proteomischen Veränderungen untersuchten. Dies ist hauptsächlich auf die geringe Gewebegröße zurückzuführen, die zur Isolierung geringer Mengen an DNA oder Protein führt, was es schwierig macht, genomische und proteomische Analysen an diesen Neuronen durchzuführen. Jedoch, in den letzten Jahren, erhöhte Nachweisempfindlichkeit hat die Entwicklung von Methoden zur Untersuchung des Genoms, miRNome und Proteom in den SCG-Neuronen während der dendritischen Wachstumsentwicklung14,15,16,17ermöglicht. In diesem Beitrag wird auch die Methode zur morphologischen Analyse dieser Neuronen mit Hilfe der Immunzytochemie und eines Protokolls zur Gewinnung neuronaler Proteinextrakte für die Massenspektrometrieanalyse beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt die Protokolle für die Kultivierung sympathischer Neuronen aus überlegenen zervikalen Ganglien embryonaler Rattenwelpen. Die Vorteile dieses Modellsystems sind, dass es möglich ist, eine homogene Population von Neuronen zu erhalten, die eine ähnliche Reaktion auf Wachstumsfaktoren bietet, und da die Wachstumsfaktoranforderungen für diese Neuronen gut charakterisiert sind, ist es möglich, diese Neuronen in vitro in definierten Medien unter serumfreien Bedingungen zu züchten<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Faculty Development Fund und das Summer Research Program Stipendium am Saint Mary es College of California unterstützt. Die Autoren möchten auch Dr. Pamela Lein von der University of California at Davis und Dr. Anthony Iavarone an der UC Berkeley Mass Spectrometry Anlage für ihre Beratung bei der Entwicklung dieser Protokolle danken. Die Autoren möchten auch Haley Nelson im Office of College Communications am Saint Mary es College of California für ihre Hilfe bei der Videoproduktion und -bearbeitung danken.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
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