חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי
Summary
מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.
Abstract
נוירונים סימפטיים מן החולדה העוברית מעולה ganglia צוואר הרחם (SCG) שימשו כמערכת מודל מבחנה עבור נוירונים היקפיים לחקור צמיחה סקסונית, סחר באקסונים, סינפטוגנזה, צמיחה דנדריטית, פלסטיות דנדריטית ואינטראקציות מטרה עצבית במערכות תרבות שותף. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והניתיקות של תאי העצב מהגרגליה צוואר הרחם מעולה של עוברי חולדה E21, ואחריו הכנה ותחזוקה של תרבויות עצביות טהורות במדיום ללא סרום. מאז נוירונים אינם לדבוק פלסטיק לא מצופה, נוירונים יהיה תרבותי על או 12 מ”מ כיסוי זכוכית או 6-well צלחות מצופה פולי-D-לינזין. לאחר טיפול עם סוכן אנטימיוטי (Ara-C, ציטוסין β-D-arabinofuranoside), פרוטוקול זה יוצר תרביות עצביות בריאות עם פחות מ 5% תאים שאינם נוירוניים, אשר ניתן לשמור במשך יותר מחודש במבחנה. למרות חולדה עוברית SCG נוירונים הם רב קוטבי עם 5-8 דנדריטים ב vivo; בתנאים ללא סרום, נוירונים אלה להרחיב רק axon אחד בתרבות ולהמשיך להיות חד קוטבי למשך כל התרבות. עם זאת, נוירונים אלה יכולים להיות מושרה להאריך דנדריטים בנוכחות תמצית קרום מרתף, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), או 10% סרום עגל עוברי. תרבויות עצביות הומוגניות אלה יכולות לשמש להכתמה חיסונית ולחקרים ביוכימיים. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמים חיסוניים עבור microtubule הקשורים חלבון-2 (MAP-2) בנוירונים אלה, להכנת תמציות עצביות לספקטרומטריה מסה.
Introduction
נוירונים סימפטיים נגזר גנגליה צוואר הרחם מעולה עוברי (SCG) שימשו באופן נרחב כמערכת תרבות עצבית ראשית לחקר היבטים רבים של התפתחות עצבית כולל תלות גורם גדילה, אינטראקציות נוירון-יעד, נוירוטרנסמיטר איתות, צמיחה סקסוני, פיתוח דנדריט ו פלסטיות, סינפטוגנזה ומנגנוני איתות הבסיסית עצב-יעד / נוירון-glia אינטראקציות1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. למרות גודלם הקטן (כ-10000 נוירונים/גנגליה), ישנן שלוש סיבות עיקריות לפיתוח ולשימוש נרחב במערכת תרבות זו הם אני) להיות הגנגליה הראשונה בשרשרת הסימפטית, הם גדולים יותר, ולכן קל יותר לבודד, מאשר שאר הגנגליה הסימפטית10; ii) בניגוד לנוירונים המרכזיים, הנוירונים ב-SCG הם הומוגניים למדי עם כל הנוירונים הנגזרים מהציצה העצבית, בעל גודל דומה, תלות בגורם גדילה עצבי ולהיות נור-adrenergic. זה הופך אותם מודל יקר ערך עבור מחקרים מורפולוגיים וגנומיים10,11 ו- iii) נוירונים אלה יכולים להישמר במדיום מוגדר ללא סרום המכיל גורם גדילהעצבי במשך יותר מחודש 10,12. נוירונים SCG Perinatal שימשו בהרחבה לחקר המנגנונים הבסיסיים ייזום ותחזוקה של דנדריטים2. הסיבה לכך היא בעיקר, למרות נוירונים SCG יש arbor דנדריטי נרחב vivo, הם לא להרחיב דנדריטים במבחנה בהיעדר סרום, אבל יכול להיות מושרה לגדול דנדריטים בנוכחות גורמי גדילה מסוימים כגון חלבונים מורפוגנטעצם 2,,12,13.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד ולקולות נוירונים SCG חולדה עוברית. במהלך 50 השנים האחרונות, תרבויות עצביות עיקריות של SCG שימשו בעיקר מחקרים מורפולוגיים עם מספר מוגבל של מחקרים הבוחנים את השינויים הגנומיים או פרוטאומיים בקנה מידה גדול. זה בעיקר בשל גודל רקמה קטנה וכתוצאה מכך בידוד של כמויות נמוכות של DNA או חלבון, מה שמקשה לבצע ניתוחים גנומיים ופרוטונומיים על נוירונים אלה. עם זאת, בשנים האחרונות, רגישות גילוי מוגברת אפשרה פיתוח של שיטות לבחון את הגנום, miRNome ופרוטומה בנוירונים SCG במהלך פיתוח צמיחהדנדריטית 14,15,16,17. מאמר זה יתאר גם את השיטה לניתוח מורפולוגי של נוירונים אלה באמצעות אימונוציטוכימיה ופרוטוקול כדי להשיג תמציות חלבון עצבי לניתוח ספקטרומטרי מסה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים לתפירת נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה של גורי חולדות עובריות. היתרונות של שימוש במערכת מודל זה הם כי ניתן להשיג אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מתן תגובה דומה גורמי גדילה, ומאז דרישות גורם גדילה עבור נוירונים אלה כבר מאופיין היטב, ניתן לגדל נוירונים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לפיתוח הפקולטה ומענק תוכנית מחקר קיץ במכללת סנט מרי של קליפורניה. המחברים גם רוצים להודות ד”ר פמלה לין באוניברסיטת קליפורניה דייוויס וד”ר אנתוני Iavarone באוניברסיטת ברקלי Mass ספקטרומטריה מתקן על עצתם במהלך הפיתוח של פרוטוקולים אלה. המחברים גם רוצים להודות להיילי נלסון במשרד לתקשורת במכללה סנט מרי של קליפורניה על עזרתה בהפקת וידאו ועריכה.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. 발생학. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. 발생학. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
