形態学およびプロテオーム解析のための胚性子宮頸部神経節からのラット交感神経の培養
Summary
本論文では、上方の頸神経節からの胚性ラット交感神経の単離と培養について述べている。また、免疫細胞化学染色や質量分析のためのニューロン抽出物の準備のための詳細なプロトコルも提供します。
Abstract
胚性ラットの優れた子宮頸神経節(SCG)の交感神経ニューロンは、軸索成長、軸索密化、シナプトジェネシス、樹状増進、樹状可塑性および共培養系における神経標的相互作用を研究するための末梢ニューロンのインビトロモデルシステムとして使用されてきた。このプロトコルは、E21ラット胚の優れた子宮頸神経節からのニューロンの分離および解離、続いて無血清培地における純粋な神経細胞培養の調製および維持について説明する。ニューロンはコーティングされていないプラスチックに付着しないため、ニューロンは12mmのガラスカバーリップまたはポリD-リジンでコーティングされた6ウェルプレートのいずれかで培養されます。抗ミトキ薬(Ara-C、シトシンβ-D-アラビノフラノシド)による治療後、このプロトコルは、5%未満の非神経細胞を有する健康な神経培養を生成し、1ヶ月以上インビトロで維持することができる。胚性ラットSCGニューロンは生体内で5〜8デンドライトを有する多極であるが、;無血清条件下では、これらのニューロンは培養中の単一の軸索のみを拡張し、培養期間中はユニポーラであり続ける。しかし、これらのニューロンは、膜内抽出物、骨形態形成タンパク質(BMP)、または10%の胎児子牛血清の存在下でデンドライトを拡張するように誘導することができる。これらの均質な神経培養は、免疫細胞化学的染色および生化学的研究に使用することができる。また、これらのニューロンにおける微小管関連タンパク質-2(MAP-2)の免疫細胞化学的染色および質量分析用のニューロン抽出物の調製に対する最適化されたプロトコルについても説明する。
Introduction
胚性優子宮頸神経膠小(SCG)由来,の交感神経細胞は、成長因子依存、神経標的相互作用、神経伝達物質シグナル伝達、軸索成長、樹状突起の発達および可塑性、神経標的/神経グリアと神経グリア相互作用の基礎となるシナプス形成およびシグナル伝達機構を,2,3,4,5,6,7含む、神経発達の多くの側面を研究するための主要な神経細胞培養システムとして広く用いられている。,8その小さなサイズ(約10000ニューロン/神経節)にもかかわらず、この培養系の開発と広範な使用の3つの主な理由は、交感神経鎖の最初の神経節であり、交感神経節10の残りの部分よりも大きく、したがって分離しやすいです。ii)中央ニューロンとは異なり、SCGのニューロンはかなり均質で、すべてのニューロンは神経堤に由来し、同様の大きさを有し、神経成長因子に依存し、またアドレナリン症である。これにより、形態学的およびゲノム学的研究のための貴重なモデル,となる10、11,11およびiii)これらのニューロンは、10、12ヶ月以上の神経成長因子を含む定義された無血清培地で維持することができる。12周産期SCGニューロンは、樹状突起2の開始および維持の根底にあるメカニズムを研究するために広く使用されてきた。これは主に、SCGニューロンは生体内に広範な樹状樹状樹状の樹状樹状のアーバーを有するが、血清の不在時にインビトロで樹状突起を拡張しないが、骨形態形成タンパク質2、12、1312,のような2特定の成長因子の存在下で樹状突起を成長させることが誘導され得るからである。13
本論文では、胚性ラットSCGニューロンを単離・培養するためのプロトコルについて述べる。過去50年間、SCGの主要な神経細胞培養は、主に大規模なゲノムまたはプロテオミクスの変化を調べる研究の限られた数で形態学的研究に使用されてきました。これは主に組織サイズが小さく、少量のDNAまたはタンパク質の単離が原因であり、これらのニューロンにゲノムおよびプロテオミクス分析を行うことが困難です。しかしながら、近年、検出感度の上昇により、樹状成長発達14、15、16、17,15の間にSCGニューロンにおけるゲノム、miRNomeおよび16プロテオームを調べる方法の開発が可能になっている。また、免疫細胞化学を用いたこれらのニューロンの形態学的解析方法と、質量分析のためのニューロンタンパク質抽出物を得るためのプロトコルについても述べる。
Protocol
動物を含む研究で行われたすべての手順は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。セントメアリーズカレッジの動物ケアと使用ガイドラインは、国立衛生研究所(https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdfおよびhttps://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf)の動物福祉研究所が提供するガイドラ…
Representative Results
胚性SCGニューロンの神経培養の分離と維持ラット胚SCGからの解離細胞は、ポリD-リジン被覆板またはカバースリップでめっきし、b神経成長因子を含む血清遊離培養培地中に維持した。ニューロンとグリア細胞の混合物を含む解解化細胞は、めっき時に円形に見える(図1A)。めっきの24時間以内に、ニューロンは位相コントラスト顕微鏡の下で位相暗くグリ?…
Discussion
本論文では、胚性ラットの上位脳神経節から交感神経を培養するためのプロトコルについて述べている。このモデルシステムを用いる利点は、成長因子に対して同様の応答を提供するニューロンの均質集団を得ることができることであり、またこれらのニューロンに対する成長因子要件が十分に特徴付けられているため、これらのニューロンを定義された培地において、無血清?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの教員開発基金とサマーリサーチプログラム助成金によって支援されました。著者らはまた、カリフォルニア大学デービス校のパメラ・レイン博士とUCバークレー質量分析施設のアンソニー・イアバロン博士に、これらのプロトコルの開発中に助言を求めて感謝したいと考えています。著者らはまた、ビデオ制作と編集に関する彼女の助けのためにカリフォルニア州セントメアリーズカレッジのカレッジコミュニケーションズオフィスのヘイリー・ネルソンに感謝したいと思います。
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
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Cite This Article
Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).