Culturing Rotte sympatiske nevroner fra embryonale overlegen cervical ganglia for morfologisk og proteomisk analyse
Summary
Dette papiret beskriver isolasjon og dyrking av embryonale rotte sympatiske nevroner fra de overlegne cervical ganglia. Det gir også detaljerte protokoller for immunocytokjemisk farging og for å forberede nevronale ekstrakter for massespektrometrisk analyse.
Abstract
Sympatiske nevroner fra embryonale rotte overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt brukt som et in vitro-modellsystem for perifere nevroner for å studere aksonal vekst, aksonal smugling, synaptogenesis, dendrittisk vekst, dendrittisk plastisitet og nervemålinteraksjoner i co-kultursystemer. Denne protokollen beskriver isolasjon og dissosiasjon av nevroner fra de overlegne livmorhalsgangene til E21 rotteembryoer, etterfulgt av preparat og vedlikehold av rene nevronale kulturer i serumfritt medium. Siden nevroner ikke holder seg til ubestrøket plast, vil nevroner bli dyrket på enten 12 mm glassdeksler eller 6-brønns plater belagt med poly-D-lysin. Etter behandling med et antimitotisk middel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside), genererer denne protokollen sunne nevronale kulturer med mindre enn 5% ikke-nevronale celler, som kan opprettholdes i over en måned in vitro. Selv om embryonale rotte SCG nevroner er multipolar med 5-8 dendritt in vivo; under serumfrie forhold strekker disse nevronene bare en enkelt axon i kultur og fortsetter å være unipolar i løpet av kulturen. Imidlertid kan disse nevronene induseres til å utvide dendrittene i nærvær av kjellermembranekstrakt, beinmorfogenetiske proteiner (BMPs), eller 10% føtal kalveserum. Disse homogene nevronale kulturene kan brukes til immunocytokjemisk farging og til biokjemiske studier. Dette papiret beskriver også optimalisert protokoll for immunocytokjemisk farging for mikrotubuli assosiert protein-2 (MAP-2) i disse nevronene og for fremstilling av nevronale ekstrakter for massespektrometri.
Introduction
Sympatiske nevroner avledet fra embryonale overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt mye brukt som et primært nevronalt kultursystem for å studere mange aspekter av nevronal utvikling, inkludert vekstfaktoravhengighet, neuron-mål interaksjoner, nevrotransmitter signalering, aksonal vekst, dendritt utvikling og plastisitet, synaptogenesis og signalmekanismer underliggende nerve-mål/ neuron-glia interaksjoner1,2,3,4,5,6,7,8,9. Til tross for sin lille størrelse (rundt 10000 nevroner / ganglia), er det tre hovedgrunner til utvikling og utstrakt bruk av dette kultursystemet er i) å være de første gangliaene i den sympatiske kjeden, de er større, og derfor lettere å isolere, enn resten av de sympatiske ganglia10; ii) i motsetning til sentrale nevroner, nevronene i SCG er ganske homogene med alle nevronene blir avledet fra nevrale crest, har en lignende størrelse, avhengighet av nerve vekstfaktor og være nor-adrenerge. Dette gjør dem til en verdifull modell for morfologiske og genomiskestudier 10,,11 og iii) disse nevronene kan opprettholdes i et definert serumfritt medium som inneholder nervevekstfaktor i over en måned10,12. Perinatal SCG nevroner har blitt mye brukt til å studere mekanismene som ligger til grunn for initiering og vedlikehold av dendritt2. Dette skyldes hovedsakelig, selv om SCG-nevroner har en omfattende dendrittisk arbor in vivo, utvider de ikke dendritt in vitro i fravær avserum,men kan induseres til å vokse dendritter i nærvær av visse vekstfaktorer som beinmorfogenetiske proteiner2,12,,13.
Dette papiret beskriver protokollen for å isolere og kultivere embryonale rotte SCG nevroner. I løpet av de siste 50 årene har primære nevronale kulturer fra SCG hovedsakelig blitt brukt til morfologiske studier med et begrenset antall studier som undersøker de store genomiske eller proteomiske endringene. Dette skyldes hovedsakelig liten vevstørrelse som resulterer i isolering av lave mengder DNA eller protein, noe som gjør det vanskelig å utføre genomiske og proteomiske analyser på disse nevronene. Men de siste årene har økt deteksjonsfølsomhet gjort det mulig å utvikle metoder for å undersøke genomet, miRNome og proteome i SCG-nevronene under dendrittisk vekstutvikling14,,15,,16,,17. Dette papiret vil også beskrive metoden for morfologisk analyse av disse nevronene ved hjelp av immunocytochemistry og en protokoll for å oppnå nevronale proteinekstrakter for massespektrologisk analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papiret beskriver protokollene for å dyrke sympatiske nevroner fra overlegne cervical ganglia av embryonale rottevalper. Fordelene ved å bruke dette modellsystemet er at det er mulig å oppnå en homogen populasjon av nevroner som gir en lignende respons på vekstfaktorer, og siden vekstfaktorkravene for disse nevronene har blitt godt karakterisert, er det mulig å vokse disse nevronene in vitro i definerte medier, under serumfrie forhold10. Selv om protokollen beskriver prosessen for å i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Faculty Development Fund og Summer Research Program stipend ved Saint Mary’s College of California. Forfatterne vil også takke Dr. Pamela Lein ved University of California ved Davis og Dr. Anthony Iavarone ved UC Berkeley Mass spektrometri anlegget for deres råd under utviklingen av disse protokollene. Forfatterne vil også takke Haley Nelson i Office of College Communications ved Saint Mary’s College of California for hennes hjelp med videoproduksjon og redigering.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
References
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. 발생학. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. 발생학. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
