Cultivar neuronas simpáticas de ratas de Ganglia cervical superior embrionario para análisis morfológico y proteómico
Summary
Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de las neuronas simpatizantes de ratas embrionarias de los ganglios cervicales superiores. También proporciona protocolos detallados para la tinción inmunocitoquímica y para la preparación de extractos neuronales para el análisis espectrométrico de masas.
Abstract
Las neuronas simpáticas de los ganglios cervicales superiores de rata embrionaria (SCG) se han utilizado como un sistema modelo in vitro para las neuronas periféricas para estudiar el crecimiento axonal, el tráfico de axonales, la sinaptogénesis, el crecimiento dendrítico, la plasticidad dendrítica y las interacciones nervio-objetivo en los sistemas de cultivo cooperativo. Este protocolo describe el aislamiento y la disociación de las neuronas de los ganglios cervicales superiores de los embriones de rata E21, seguido de la preparación y el mantenimiento de cultivos neuronales puros en medio libre de suero. Dado que las neuronas no se adhieren al plástico sin recubrimiento, las neuronas se cultivarán en cubiertas de vidrio de 12 mm o placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina. Después del tratamiento con un agente antimitotico (Ara-C, citosina-D-arabinofuranoside), este protocolo genera cultivos neuronales saludables con menos del 5% de células no neuronales, que se pueden mantener durante más de un mes in vitro. Aunque las neuronas de SCG de rata embrionaria son multipolares con 5-8 dendritas in vivo; en condiciones libres de suero, estas neuronas extienden sólo un axón en el cultivo y continúan siendo unipolares durante el cultivo. Sin embargo, estas neuronas se pueden inducir para extender las dendritas en presencia de extracto de membrana del sótano, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), o 10% suero de ternera fetal. Estos cultivos neuronales homogéneos se pueden utilizar para la tinción inmunocitoquímica y para estudios bioquímicos. Este artículo también describe el protocolo optimizado para la tinción inmunocitoquímica para la proteína asociada a microtúbulos-2 (MAP-2) en estas neuronas y para la preparación de extractos neuronales para espectrometría de masas.
Introduction
Las neuronas simpáticas derivadas de los ganglios cervicales superiores embrionarios (SCG) se han utilizado ampliamente como un sistema de cultivo neuronal primario para estudiar muchos aspectos del desarrollo neuronal, incluida la dependencia del factor de crecimiento, interacciones neuron-target, señalización de neurotransmisores, crecimiento axonal, desarrollo de dendrita y plasticidad, sinaptogénesis y mecanismos de señalización subyacentes a las interacciones nervio-objetivo/neurona-glia1,2,3,4,5,6,7,8,9. A pesar de su pequeño tamaño (alrededor de 10000 neuronas/ganglia), hay tres razones principales para el desarrollo y el uso extensivo de este sistema de cultivo son i) siendo los primeros ganglios en la cadena simpática, son más grandes, y por lo tanto más fáciles de aislar, que el resto de los ganglios simpáticos10; ii) a diferencia de las neuronas centrales, las neuronas en el SCG son bastante homogéneas con todas las neuronas que se derivan de la cresta neural, teniendo un tamaño similar, dependencia del factor de crecimiento nervioso y ser no-adrenergic. Esto los convierte en un modelo valioso para los estudios morfológicos y genómicos10,,11 y iii) estas neuronas se pueden mantener en un medio sin suero definido que contiene factor de crecimiento nervioso durante más de un mes10,,12. Las neuronas SCG perinatales se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos subyacentes a la iniciación y mantenimiento de dendritas2. Esto se debe principalmente a que, aunque las neuronas SCG tienen un árbol pródrico extenso in vivo, no extienden las dendritas in vitro en ausencia de suero, sino que pueden ser inducidas a crecer dendritas en presencia de ciertos factores de crecimiento como las proteínas morfogenéticas óseas2,,12,,13.
Este artículo describe el protocolo para aislar y cultivar las neuronas DE SCG de rata embrionaria. En los últimos 50 años, las culturas neuronales primarias del SCG se han utilizado principalmente para estudios morfológicos con un número limitado de estudios que examinan los cambios genómicos o proteómicos a gran escala. Esto se debe principalmente al pequeño tamaño del tejido que resulta en el aislamiento de bajas cantidades de ADN o proteína, lo que dificulta la realización de análisis genómicos y proteómicos en estas neuronas. Sin embargo, en los últimos años, el aumento de la sensibilidad de detección ha permitido el desarrollo de métodos para examinar el genoma, miRNome y proteoma en las neuronas SCG durante el desarrollo del crecimiento dendrítico14,,15,,16,,17. Este artículo también describirá el método para el análisis morfológico de estas neuronas utilizando inmunocitoquímica y un protocolo para obtener extractos de proteína neuronal para el análisis espectrométrico de masas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe los protocolos para el cultivo de neuronas simpáticas de ganglios cervicales superiores de cachorros de rata embrionaria. Las ventajas de utilizar este sistema modelo son que es posible obtener una población homogénea de neuronas proporcionando una respuesta similar a los factores de crecimiento, y dado que los requisitos del factor de crecimiento para estas neuronas ha sido bien caracterizado, es posible crecer estas neuronas in vitro en medios definidos, en condiciones libres de suero<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Desarrollo Docente y del Programa de Investigación de Verano en el Saint Mary’s College of California. Los autores también quieren agradecer a la Dra. Pamela Lein de la Universidad de California en Davis y al Dr. Anthony Iavarone en la instalación de espectrometría de masas de UC Berkeley por sus consejos durante el desarrollo de estos protocolos. Los autores también quieren agradecer a Haley Nelson en la Oficina de Comunicaciones Universitarias del Saint Mary’s College of California por su ayuda con la producción y edición de videos.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
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