Denne protokollen er utviklet for å studere dimer-dodecamer overgangen av TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på strukturelt nivå. Det er en enkel rørledning som starter fra proteinrensing til røntgendatabehandling. Krystalllogenese, datasettindeksering og molekylær erstatning har blitt vektlagt gjennom et tilfelle av studier, TmPep1050H60A H307A-variant.
M42 aminopeptidaser danner funksjonelt aktive komplekser laget av 12 underenheter. Deres monteringsprosess ser ut til å være regulert av deres metallionkofaktorer som utløser en dimer-dodecamer overgang. Ved binding av metallion forekommer flere strukturelle modifikasjoner på det aktive stedet og på interaksjonsgrensesnittet, og former dimers for å fremme selvmonteringen. For å observere slike modifikasjoner må stabile oligomerer isoleres før strukturstudier. Rapportert her er en metode som tillater rensing av stabile dodecamers og dimers av TmPep1050, en M42 aminopeptidase av T. maritima, og deres struktur bestemmelse av røntgenkrystallografi. Dimers ble utarbeidet fra dodecamers ved å fjerne metallioner med et chelating middel. Uten sin kofaktor ble dodecamers mindre stabile og ble fullstendig dissosiert ved oppvarming. De oligomeriske strukturene ble løst ved den enkle molekylære erstatningstilnærmingen. For å illustrere metodikken presenteres strukturen til en TmPep1050-variant, helt svekket i metallionbinding, som ikke viser ytterligere nedbryting av dimers til monomerer.
Oligomerisering er en dominerende prosess som dikterer de biologiske funksjonene til mange proteiner. I Escherichia colier det anslått at bare 35% av proteinene er monomeriske1. Noen proteiner, kalt morfoseiner, kan til og med vedta flere oligomeriske tilstander med underenheter som har distinkt struktur i hver oligomeriske tilstand2. Overgangen mellom deres oligomeriske tilstander er ofte et middel til å regulere proteinaktivitet, da hver oligomeriske tilstand kan ha en annen spesifikk aktivitet eller funksjon. Flere eksempler på morfoeiner har blitt godt dokumentert i litteraturen, spesielt porphobilinogen synthase3, HPr kinase / fosfat dehydrogenase7, pyruvat dehydrogenase6, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase7, pyruvat kinase8, citrate synthase9, og ribonuclease A10. Nylig beskrev vi M42 aminopeptidase TmPep1050, et annet eksempel på enzym med morfeeinlignende oppførsel, hvis aktivitet avhenger av oligomeriske tilstander11. Overgangen mellom de oligomeriske statene er mediert av sine metalliske kofaktorer som induserer flere strukturelle modifikasjoner av underenhetene.
M42 aminopeptidase familien tilhører MH klanen12,13, og er utbredt blant bakterier og Arkaea14. M42 aminopeptidasene er ekte dinukleærenzymer som nedbryter peptider opptil 35 aminosyrerester i lengde15. De vedtar en særegen tetrahedron-formet struktur laget av 12 underenheter med sine aktive steder orientert mot et indre hulrom. Et slikt arrangement blir ofte beskrevet som en nano-compartmentalization av aktiviteten for å unngå ukontrollert proteolyse. Den fysiologiske funksjonen til M42 aminopeptidasene kan være forbundet med proteasom, hydrolyserende peptider som følge av proteinnedbrytning16,17. Pyrococcus horikoshii har fire M42 aminopeptidaser, hver presenterer distinkte, men komplementære spesifisiteter18,19,20,21. Entall, heterocomplexes laget av to forskjellige typer underenheter har blitt beskrevet i P. horikoshii, noe som tyder på eksistensen av peptidasome komplekser22,23.
Flere strukturer av M42 aminopeptidaser har blitt beskrevet ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheten består av to forskjellige domener, et katalytisk domene og et dimmeriseringsdomene. Det katalytiske domenet vedtar en felles α / β fold bevart i hele MH-klanen, det arketypiske katalytiske domenet er aminopeptidase Ap1 av Vibrio proteolyticus27. Dimeriseringdomenet vedtar en PDZ-lignende fold16 og kan ha, i tillegg til sin rolle i oligomeriseringen, en rolle i å kontrollere substrattilgang og binding i det indrehulrommet 11. Som den grunnleggende byggesteinen er en dimer, blir dodecamer ofte beskrevet som foreningen av seks dimers, hver dimer blir plassert på hver kant av tetrahedron16. Oligomeriseringen av M42-aminopeptidasene er avhengig av tilgjengeligheten av metallkofaktorene. Divalente metallioner, ofte Zn2+ og Co2+, er katalytisk involvert i peptidbindingen og hydrolysen. De finnes i to forskjellige bindingssteder, nemlig M1 og M2 nettsteder. De to metallionene kjører og finjusterer også oligomeriseringen som demonstrert for PhTET2, PhTET3, PfTET3 og TmPep105011,24,28,29. Når metallkofaktorene er tømt, demonteres dodecameren i dimers, som i PhTET2, PhTET3 og TmPep105011,16,28eller til og med monomerer, som i PhTET2 og PfTET324,29.
Presentert her er en protokoll som brukes for å studere strukturene til TmPep1050 oligomers. Denne protokollen er et sett med vanlige metoder, inkludert proteinrensing, proteolytisk aktivitetsscreening, krystallisering, røntgendiffraksjon og molekylær erstatning. Finesser som er iboende til å håndtere metalloenzymer, protein oligomerisering, proteinkrystallisering og molekylær erstatning er vektlagt. Et tilfelle av studier er også presentert for å vise om TmPep1050 dodecamers kan ytterligere dissosiere til monomerer eller ikke. For å løse dette spørsmålet har en TmPep1050-variant, TmPep1050H60A H307A, blitt studert hvis metallbindingssteder er svekket ved å mutere His-60 (M2-området) og His-307 (M1-området) til Ala-rester. Denne protokollen kan innkvarteres for å studere andre M42 aminopeptidaser eller metalloenzymer med morfoein-lignende atferd.
Protokollen som er beskrevet her, gjør det mulig å forstå den dimer-dodecamer overgangen til TmPep1050 på strukturnivå. Metodikken ble opplevd tidligere for å bestemme strukturen til både TmPep1050 oligomers11. Det mest utfordrende trinnet var å finne forhold som fremmet dissosiasjon av dodecamers til stabile dimers. Slike forhold måtte være milde nok til å tillate reassociation av dimers i dodecamers når metallionkofaktoren ble lagt til. Separasjonen av oligomerer var også et kritisk…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Martine Roovers for korrekturlesing av dette papiret og gi konstruktive kommentarer. Tilgang til Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var innenfor Block Allocation Groups 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |