JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Este protocolo foi desenvolvido para estudar a transição dimer-dodecamer de TmPep1050, uma aminopeptidase M42, no nível estrutural. É um pipeline simples desde a purificação de proteínas até o processamento de dados de raios-X. A cristalogênese, a indexação do conjunto de dados e a substituição molecular foram enfatizadas através de um caso de estudo, a variante TmPep1050H60A H307A.

Abstract

As aminopeptidases M42 formam complexos funcionalmente ativos feitos de 12 subunidades. Seu processo de montagem parece ser regulado por seus cofatores de íons metálicos desencadeando uma transição dimer-dodecamer. Após a ligação de íon metálico, várias modificações estruturais ocorrem no local ativo e na interface de interação, moldando dimers para promover a auto-montagem. Para observar tais modificações, os oligômeros estáveis devem ser isolados antes do estudo estrutural. Relatado aqui é um método que permite a purificação de dodecamers estáveis e dimers de TmPep1050, um M42 aminopeptidase de T. maritima, e sua determinação estrutural por cristalografia de raios-X. Dimers foram preparados de dodecamers removendo íons metálicos com um agente quelaante. Sem seu cofator, os dodecamers tornaram-se menos estáveis e foram totalmente dissociados após o aquecimento. As estruturas oligomeméricas foram resolvidas pela abordagem de substituição molecular direta. Para ilustrar a metodologia, a estrutura de uma variante TmPep1050, totalmente prejudicada na ligação de íons metálicos, é apresentada sem mais quebra de dimers aos monômeros.

Introduction

A oligomerização é um processo predominante que dita as funções biológicas de muitas proteínas. Em Escherichia coli,estima-se que apenas 35% das proteínas são monoméricas1. Algumas proteínas, chamadas morfinas, podem até adotar vários estados oligomericos com subunidades com estrutura distinta em cada estado oligomerico2. A transição entre seus estados oligomericos é frequentemente uma média para regular a atividade proteica, pois cada estado oligomerico pode ter uma atividade ou função específica diferente. Vários exemplos de morfinas foram bem documentados na literatura, notavelmente o porfobilinogen synthase3, HPr kinase/fosphatase4, Lon protease5, lactato desidrogenase6, glicealdeído-3-fosfato desidrogenase7, pyruato kinase8, citrato synthase9, e ribonuclease A10. Recentemente, descrevemos o M42 aminopeptidase TmPep1050, outro exemplo de enzima com comportamento semelhante à morfina, cuja atividade depende de seus estados oligoméricos11. A transição entre seus estados oligoméricos é mediada por seus cofatores metálicos que induzem várias modificações estruturais das subunidades.

A família Aminopeptidase M42 pertence ao clã MH12,13, e é amplamente distribuída entre bactérias e Archaea14. As aminopeptidases M42 são enzimas dinucleares genuínas que degradam peptídeos até 35 resíduos de aminoácidos no comprimento15. Eles adotam uma estrutura peculiar em forma de tetraedro feita de 12 subunidades com seus locais ativos orientados para uma cavidade interna. Tal arranjo é frequentemente descrito como uma nano-compartimentação da atividade para evitar a proteólise descontrolada. A função fisiológica das aminopeptidases M42 pode estar associada aos peptídeos protealôs e hidrolise resultantes da degradação proteica16,17. Pyrococcus horikoshii possui quatro aminopeptidases M42, cada uma apresentando especificidades distintas, mas complementares18,19,20,21. Singularmente, heterocomplexos feitos de dois tipos diferentes de subunidades foram descritos em P. horikoshii, sugerindo a existência de complexos peptidasome22,23.

Várias estruturas de aminopeptidases M42 foram descritas na literatura11,16,18,19,20,24,25,26. A subunidade é composta de dois domínios distintos, um domínio catalítico e um domínio de dimerização. O domínio catalítico adota uma dobra de α/β comum conservada em todo o clã MH, sendo o domínio catalítico arquetípico o Aminopeptidase Ap1 do Vibrio proteolyticus27. O domínio de dimerização adota uma dobra16 semelhante a PDZ e pode ter, além de seu papel na oligomerização, um papel no controle do acesso substrato e vinculação na cavidade interna11. Como o bloco de construção básico é um dimer, o dodecamer é frequentemente descrito como a associação de seis dimers, cada escurecer sendo posicionado em cada borda do tetraedro16. A oligomerização das aminopeptidases M42 depende da disponibilidade de seus cofatores metálicos. Íons metálicos divalentos, muitas vezes Zn2+ e Co2+, estão catalíticos envolvidos na ligação de peptídeos e hidrólise. Eles são encontrados em dois locais de ligação distintos, ou seja, locais M1 e M2. Os dois íons metálicos também dirigem e ajustam finamente a oligomerização como demonstrado para PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep105011,24,28,29. Quando os cofatores metálicos estão esgotados, o dodecamer desmonta em dimers, como em PhTET2, PhTET3 e TmPep105011,16,28, ou mesmo monômeros, como em PhTET2 e PfTET324,29.

Apresentado aqui é um protocolo utilizado para estudar as estruturas de oligômeros TmPep1050. Este protocolo é um conjunto de métodos comuns, incluindo purificação de proteínas, triagem de atividade proteolítica, cristalização, difração de raios-X e substituição molecular. São enfatizadas sutilezas inerentes ao enfrentamento das metalloenzymias, oligomerização de proteínas, cristalização de proteínas e substituição molecular. Um caso de estudo também é apresentado para mostrar se os dodecamers TmPep1050 podem se dissociar ainda mais em monômeros ou não. Para abordar essa questão, uma variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A,foi estudada cujos locais de ligação metálica são prejudicados pela mutação de Seu-60 (local M2) e Seu-307 (local M1) para resíduos de Ala. Este protocolo pode ser acomodado para estudar outras aminopeptidases M42 ou quaisquer metalloenzymes com comportamento semelhante à morfina.

Protocol

1. Produção e purificação de recombinante TmPep1050 NOTA: A partir de agora são descritos o procedimento de clonagem e purificação do TmPep1050 do tipo selvagem adaptado de um estudo anterior11. Alternativamente, a clonagem pode ser feita usando um gene sintético. Para gerar variantes TmPep1050, a mutagênese direcionada ao site pode ser realizada seguindo, por exemplo, as reações de primer único no método de protocolo paralelo (SPRINP)30</su…

Representative Results

Para estudar uma possível dissociação dodecamer em monômeros em TmPep1050, os códons His-60 e His-307 foram substituídos por codons alanino usando um gene sintético. Este gene foi então clonado no vetor pBAD para expressão e purificação da variante TmPep1050 correspondente posteriormente chamada TmPep1050H60A H307A. A cromatografia de exclusão de tamanho(Figura 3B)mostrou que a proteína purificada tinha um peso molecular aparente de 56 kDa (peso molecular do monômero…

Discussion

O protocolo aqui descrito permite compreender a transição dimer-dodecamer de TmPep1050 no nível estrutural. A metodologia foi experimentada anteriormente para determinar a estrutura de ambos os oligômeros TmPep105011. O passo mais desafiador foi encontrar condições que promovessem a dissociação dos dodecamers em escurecimentos estáveis. Tais condições tinham que ser leves o suficiente para permitir a reassociação de dimers em dodecamers quando o cofator de íons metálicos foi adicion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Martine Roovers por revisar este artigo e fazer comentários construtivos. O acesso à linha de feixe Proxima 2 (síncrotron SOLEIL) estava dentro dos Grupos de Alocação de Blocos 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. 생화학. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration
check_url/kr/61288?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image