Cristalografía de rayos X para estudiar la transición del estado oligomérico de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidasse TmPep1050

Summary

Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar la transición dimer-dodecamer de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa, a nivel estructural. Es una tubería sencilla que va desde la purificación de proteínas hasta el procesamiento de datos de rayos X. La cristalgénesis, la indexación de conjuntos de datos y el reemplazo molecular se han enfatizado a través de un caso de estudio, la variante TmPep1050_{H60A H307A.}

Abstract

Los aminopeptidases M42 forman complejos funcionalmente activos hechos de 12 subunidades. Su proceso de montaje parece estar regulado por sus cofactores de iones metálicos que desencadenan una transición dimer-dodecamer. Tras la unión de iones metálicos, se producen varias modificaciones estructurales en el sitio activo y en la interfaz de interacción, dando forma a los dimers para promover el autoensamble. Para observar tales modificaciones, los oligómeros estables deben aislarse antes del estudio estructural. Reportado aquí es un método que permite la purificación de dodecamers estables y dimers de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa de T. maritima,y su determinación de la estructura por cristalografía de rayos X. Los dimers se preparaban a partir de dodecamers mediante la eliminación de iones metálicos con un agente quelante. Sin su cofactor, los dodecamers se volvieron menos estables y se disociaron por completo al calentarse. Las estructuras oligoméricas fueron resueltas por el enfoque de reemplazo molecular sencillo. Para ilustrar la metodología, la estructura de una variante TmPep1050, totalmente deteriorada en la unión de iones metálicos, se presenta mostrando ninguna descomposición adicional de dimers a monómeros.

Introduction

La oligomerización es un proceso predominante que dicta las funciones biológicas de muchas proteínas. En Escherichia coli, se estima que sólo el 35% de las proteínas son monoméricas^1. Algunas proteínas, llamadas morfeínas, pueden incluso adoptar varios estados oligoméricos con subunidades que tienen una estructura distinta en cada estado oligomérico^2. La transición entre sus estados oligoméricos es a menudo un medio para regular la actividad proteica ya que cada estado oligomérico puede tener una actividad o función específica diferente. Varios ejemplos de morfeeeinas han sido bien documentados en la literatura, en particular el porphobilinogen synthase³, HPr kinasa/phosphatase⁴, Lon proteasa⁵, lactato deshidrogenasa⁶, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa⁷, pirateuvasa⁸, cito de lactato⁹, y ribonusa^{10 .} Recientemente, describimos el M42 aminopeptidasa TmPep1050, otro ejemplo de enzima con comportamiento similar a la morfeína, cuya actividad depende de sus estados oligoméricos¹¹. La transición entre sus estados oligoméricos está mediada por sus cofactores metálicos que inducen varias modificaciones estructurales de las subunidades.

La familia M42 aminopeptidasa pertenece al clan MH^12,13,y se distribuye ampliamente entre Bacterias y Archaea^14. Los aminopeptidases M42 son enzimas dinucleares genuinas degradando péptidos hasta 35 residuos de aminoácidos en longitud¹⁵. Adoptan una peculiar estructura en forma de tetraedro hecha de 12 subunidades con sus sitios activos orientados hacia una cavidad interna. Tal disposición se describe a menudo como una nano-compartimentación de la actividad para evitar la proteólisis incontrolada. La función fisiológica de las aminopeptidasas M42 puede estar asociada con el proteosoma, péptidos hidrolizantes resultantes de la degradación de proteínas^16,17. Pyrococcus horikoshii posee cuatro Aminopeptidases M42, cada uno presentando especificidades distintas pero complementarias^18,19,20,21. Singularmente, heterocomplejos hechos de dos tipos diferentes de subunidades se han descrito en P. horikoshii, sugiriendo la existencia de complejos peptidasome^22,23.

Varias estructuras de M42 aminopeptidases se han descrito en la literatura^{11,16,18,19,20,24,25,26}. La subunidad se compone de dos dominios distintos, un dominio catalítico y un dominio de dimerización. El dominio catalítico adopta un pliegue común α/β conservado en todo el clan MH, siendo el dominio catalítico arquetípico la aminopeptidasa Ap1 de Vibrio proteolyticus²⁷. El dominio de dimerización adopta un pliegue similar a la^{PDS 16} y puede tener, además de su papel en la oligomerización, un papel en el control del acceso al sustrato y la unión en la cavidad interna¹¹. Como el bloque de construcción básico es un dimer, el dodecamer se describe a menudo como la asociación de seis dimers, cada dimer se coloca en cada borde del tetraedro¹⁶. La oligomerización de los aminopeptidases M42 depende de la disponibilidad de sus cofactores metálicos. Los iones metálicos divalentes, a menudo Zn²⁺ y Co^2+,participan catalíticamente en la unión a péptidos y la hidrólisis. Se encuentran en dos sitios de enlace distintos, a saber, los sitios M1 y M2. Los dos iones metálicos también conducen y afinan finamente la oligomerización como se demuestra para PhTET2, PhTET3, PfTET3 y TmPep1050^11,24,28,29. Cuando se agotan los cofactores metálicos, el dodecamer se desmonta en dimers, como en PhTET2, PhTET3, y TmPep1050^11,16,28,o incluso monómeros, como en PhTET2 y PfTET3^24,29.

Aquí se presenta un protocolo utilizado para estudiar las estructuras de los oligómeros TmPep1050. Este protocolo es un conjunto de métodos comunes que incluyen purificación de proteínas, cribado de actividad proteolítica, cristalización, difracción de rayos X y reemplazo molecular. Se enfatizan las sutilezas inherentes al tratamiento de las metaloenzimas, la oligomerización de proteínas, la cristalización de proteínas y el reemplazo molecular. También se presenta un caso de estudio para mostrar si los dodecamers TMPep1050 pueden disociarse aún más en monómeros o no. Para abordar esta pregunta, se ha estudiado una variante TmPep1050, TmPep1050_{H60A H307A,}cuyos sitios de unión de metales se ven deteriorados al mutar His-60 (sitio M2) e His-307 (sitio M1) a los residuos de Ala. Este protocolo puede ser acomodado para estudiar otros Aminopeptidases M42 o cualquier metaloenzimas con comportamiento morfeina-como.

Protocol

1. Producción y purificación del recombinante TmPep1050 NOTA: A continuación se describe el procedimiento de clonación y purificación de tmpep1050 de tipo salvaje adaptado de un estudio anterior11. Alternativamente, la clonación se puede hacer usando un gen sintético. Para generar variantes TmPep1050, se puede realizar mutagénesis dirigida por el sitio siguiendo, por ejemplo, las reacciones de imprimación única en el método30del protocol…

Representative Results

Para estudiar una posible disociación dodecamer en monómeros en TmPep1050, los codones His-60 e His-307 fueron reemplazados por codón de alanina usando un gen sintético. Este gen fue clonado en vector pBAD para la expresión y purificación de la variante tmPep1050 correspondiente posteriormente denominada TmPep1050H60A H307A. La cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 3B) mostró que la proteína purificada tenía un peso molecular aparente de 56 kDa (el peso molecula…

Discussion

El protocolo descrito aquí permite comprender la transición dimer-dodecamer de TmPep1050 a nivel estructural. La metodología fue experimentada anteriormente para determinar la estructura de ambos oligómeros TmPep1050¹¹. El paso más difícil fue encontrar condiciones que promuevan la disociación de los dodecamers en dimers estables. Tales condiciones tenían que ser lo suficientemente suaves como para permitir la reasociación de los dimers en los dodecamers cuando se añadió el cofactor de …

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma-Aldrich	13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K	Merck Millipore	UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K	Merck Millipore	UFC903024
Benzonase Nuclease	Merck Millipore	70664-3
CCP4	N/A		visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free	Roche	5056489001
Coot	N/A		visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I	Hampton Research	HR2-110
Crystal Screen II	Hampton Research	HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1082
EasyXtal 15-well tool	NeXtal	132007
Escherichia coli PPY strain	N/A		see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain	Agilent	200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW	GE Healthcare Life Sciences	28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW	GE Healthcare Life Sciences	28-4038-41
Gel Filtration Standard	Biorad	1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	ThermoFisher Scientific	K0503
Index	Hampton Research	HR2-144
Litholoops	Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide	Bachem AG	40010720025
Natrix 1	Hampton Research	HR2-116
Natrix 2	Hampton Research	HR2-117
Neggia plugin	Dectris	N/A	visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I	NeXtal	130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II	NeXtal	130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III	NeXtal	130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV	NeXtal	130727
pBAD-TOPO	ThermoFisher Scientific	K430001
Phenix	N/A		visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	ThermoFisher Scientific	F-530L
Salt RX 1	Hampton Research	HR2-107
Salt RX 2	Hampton Research	HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO	ThermoFisher Scientific	88242
Source 15Phe	GE Healthcare Life Sciences	17014702
Source 15Q	GE Healthcare Life Sciences	17094705
Superdex 200 prep grade	GE Healthcare Life Sciences	17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain	American Type Culture Collection	ATCC 43589
TmCD00089984	DNASU Plasmid Repository	N/A
XDS	N/A		visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme	N/A		visit https://github.com/legrandp/xdsme