En automatiserad Differentiell Nuclear Färgning Assay för exakt bestämning av Mitocan Cytotoxicitet
Summary
Protokollet beskriver en snabb, hög genomströmning, tillförlitlig, billig och opartisk analys för att effektivt bestämma cellulär livskraft. Denna analys är särskilt användbar när cellernas mitokondrier har skadats, vilket stör andra analyser. Analysen använder automatiserad räkning av celler färgas med två nukleära färgämnen – Hoechst 33342 och propidium iodide.
Abstract
Mitokondriernas bidrag till onogen omvandling är ett ämne av stort intresse och aktiv studie. Eftersom området cancer metabolism blir mer komplex, målet att rikta mitokondrierna med hjälp av olika föreningar som orsakar mitokondriell skada (så kallade mitokaner) blir ganska populär. Tyvärr, många befintliga cytotoxicitet analyser, såsom de baserade på tetrazolium salter eller resazurin kräver funktionella mitokondriellt enzymer för deras prestanda. De skador som orsakas av föreningar som riktar mitokondrierna ofta äventyrar noggrannheten i dessa analyser. Här beskriver vi ett modifierat protokoll baserat på differentialfärgning med två fluorescerande färgämnen, varav en är cellpermeant (Hoechst 33342) och den andra av som inte är (propidium iodid). Skillnaden i färgning gör att levande och döda celler kan diskrimineras. Analysen är mottaglig för automatiserad mikroskopi och bildanalys, vilket ökar genomströmningen och minskar bias. Detta gör det också möjligt för analysen att användas i hög genomströmning mode med 96-brunns plattor, vilket gör det till ett lönsamt alternativ för drogupptäckt insatser, särskilt när drogerna i fråga har en viss nivå av mitotoxicitet. Viktigt, resultat som erhållits genom Hoechst /PI färgning analys visar ökad konsistens, både med trypan blå utslagning resultat och mellan biologiska replikat när analysen jämförs med andra metoder.
Introduction
Det första steget för att identifiera effektiva cancerbehandlingar är valet av en robust, opartisk cytotoxicitetsanalys som kan användas för att undersöka effekten av behandlingen. Ett vanligt val för låg-genomströmning experiment är uteslutandet av trypan blått färgämne från levande celler. Denna metod gynnas eftersom det tillåter en relativt opartisk metod för att kvantifiera cell överlevnad. trypan blå sprider passivt till celler vars membran äventyras, men det är effektivt blockeras från att komma in friska celler1. Kvoten av de levande cellerna och de totala cellerna representerar procentens livskraft, vilket indikerar effekten av behandlingen. Den mest betydande nackdelen med trypan blå analysen är att det är dåligt lämpad för hög-genomströmningsmetoder. Den har en relativt låg signal-brus-förhållande och långvarig färgning kan resultera i artefakter på grund av färgning av livskraftiga celler. Följaktligen trypan blå uteslutning är typiskt, men inte alltid2, förpassas till manuell räkning. Detta gör det för långsamt och inför den starka möjligheten till partiskhet på grund av subjektiva dom av forskaren (om inte bländande eller oberoende räknas, vilket ytterligare minskar laboratoriegenomströmningen). I allmänhet är genomströmningen av denna analys otillräcklig för modern läkemedelsupptäckt.
Lönsamhetsanalyser, som i allmänhet har en mycket högre genomströmning, gör det möjligt för forskare att kringgå denna begränsning, men kommer med betydande förbehåll (se tabell 1). Dessa metoder faller i allmänhet i två grupper. En grupp består av koloritiska analyser som är baserade på funktionen av cellulära redoxenzymer. Färglösa eller icke-fluorescerande substrat omvandlas till livfulla produkter som kan kvantifieras med hjälp av en spektrofotometer. Klassiska exempel är tetrazoliumsalter (MTT, WST-1, XTT, etc.) och resazurin. Denna kategori innehåller också självlysande analyser som utnyttjar luciferin för att utvärdera ATP-nivå. Assays av denna typ har den underliggande begränsningen att de mäter cellulär metabolism, som inte är cellulär viability per se. Det är ganska vanligt att celler blir quiescent under ogynnsamma förhållanden, men ändå behålla förmågan att dela3,4,5. Till exempel, cancer stamceller är ofta relativt metaboliskt quiescent6,7,8,9, och kommer sannolikt att vara svårt att assay med hjälp av dessa tekniker. Effektiviteten av behandlingar som skadar mitokondriell funktion, såsom de flesta mitokaner, är också sannolikt att vara betydligt överskattad.
En alternativ metodik utnyttjar de kemiska egenskaperna hos olika ämnen som gör det möjligt för dem att antingen korsa eller inte korsa biologiska membran. Ett exempel är nukleära fläckar som SYTOX eller propidium iodide (PI). Denna kategori omfattar även analyser som är liknande i begreppet men olika i funktion, såsom laktatdehydrogenas (LDH) analys, som mäter utsläpp av LDH i den extracellulära miljön som en indikator på cellulär nekros (Figur 1, Tabell 1). Dessa analyser är mer kapabla att skilja mellan metaboliskt inaktiva och döda celler.
| Analys/färgämne | Typ(er) av celldöden upptäckt | Nödvändig utrustning | Viktiga funktioner |
| MTT, CKK-8, Alamar Blå (resazurin) | Apoptos/Nekros | Spektrofotometer | Billigt, snabbt; endpoint-analys; beroende av enzymernas aktivitet (uteslutande mitokondriellt vid MTT) och inte diskriminerar mellan celldödslägen1,10 |
| LDH-utgåva | Nekros | Spektrofotometer | Snabb, oberoende av mitokondriellt enzymers aktivitet; dyrt för tester med hög genomströmning, upptäcker nekrotiska celler med kompenserat plasmamembran11,12 |
| Trypan Blå (TB) | Apoptos/Nekros | Mikroskop | Cell-impermeant; inte diskriminerar mellan celldödslägena, laborous och inte lämplig för hög genomströmning screening; svårare att använda med anhängare celler; benägna att subjektivt omdöme av användaren, men anses vara standard cellens livskraft mätmetod13 |
| Acridine orange (AO) | Apoptos/Nekros/ | Fluorescensmikroskop | En nukleinsyra färgämne med unika spektrala egenskaper, kan skilja mellan apoptos och nekros / necroptosis14 |
| Necroptosis | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptos | Fluorescensmikroskop eller flödescytometer | Cell-genomsläpplig; olämpligt på egen hand för att övervaka celldöden; användbart för co-färgning; kan användas för att bedöma kromatinkondensering och nukleifragmentering i tidig apoptos; kan paras ihop med propidium-iodid för att skilja apoptos från nekros15,16 |
| Propidium iodid (PI) | Sen apoptos/Nekros | Fluorescensmikroskop eller flödescytometer | Cell-impermeant intercalator; upptäcker både sen apoptos och nekros lägen för celldöd17. Giftigt och genomsläppligt efter långa inkubationstider18 |
Tabell 1. Lista över cytotoxicitetsanalyser. Cytotoxicitet assays, av vilka några användes i denna studie, anges tillsammans med kort beskrivning av deras nyckelfunktioner.
Nyligen genomförda studier har visat att mitokondriell metabolism ändras i vissacancerformer 19,20,21,22,23,24,25. Till exempel har akut myeloisk leukemier (AML) visats upregulate deras mitokondriell massa, mtDNA innehåll, och mitokondriell andning för att möta deras energi krav19,26,27. Å andra sidan, vissa solida tumörer kännetecknas av mitokondriell dysfunktion, eller snarare “metabolisk omprogrammering”, såsom nedreglering av mitokondriellt proteiner som deltar i OXPHOS eller minskad mtDNA innehåll, som har associerats med tumörinvasivitet, metastaserande potential och resistens mot apoptos-inducerandeläkemedel 28,29. Dessutom, nyligen, Det har varit ett ökat intresse för att använda mekanistiskt olika föreningar som påverkar mitokondriell funktion (allmänt kallas mitokaner30), som potentiella terapier för särskilda cancerformer. Dessa läkemedel mål ATP syntes, mitokondriellt DNA, OXPHOS, och ROS produktion, samt pro-apoptotiska och anti-apoptotiska proteiner i samband med mitokondrierna30,31. Flera studier har visat att detta tillvägagångssätt har betydandelöfte 19,32,33,34. Dessa metaboliska avvikelser i cancer cellbiologi eller mitokondrier-inriktning behandlingar kan dock avsevärt påverka konventionella lönsamhet assays som är baserade på mitokondriell funktionalitet.
Här beskrivs ett optimerat protokoll för en differentiell kärnfärgningsanalys. Protokollet tillåter snabb och noggrann bestämning av cytotoxicitet av mitokaner eller deras kombinationer med andra föreningar. Hoechst 33342 är ett cellpermeant kärnämne som lätt korsar cellmembran för att fläcka DNA, vilket gör att det totala celltalet kan erhållas. Genom co-färgning med PI, som bara kommer in i kärnorna av döda celler, kan andelen levande (Endast Hoechst) och döda (färgas med båda) celler exakt fastställas. Detta protokoll förfinar den publicerade analysen35 genom att lägga till ett steg för optimering av färgämnet koncentration (genom korsreferering resultat med ortogonal trypan blå metod) och centrifugeringen av plattan före bildbehandling. Eftersom många cellinjer är halvhäftande eller upphängda ökar centrifugeringen andelen celler som avbildas och förbättrar starkt noggrannheten. Analysen har flera fördelar, bland annat att färgning inte kräver borttagning av media eller tvättning. Färgämnet blandningen är också billig, lätt att förbereda, och kompatibel med flerkanals -/robotpittersystem.
Efter celler har färgats, de avbildas med ett automatiserat mikroskop. Detta har den extra fördelen att skapa en permanent post av de bilder som kan analyseras på nytt senare och effekterna av särskilda föreningar kan omvärderas genom visuell inspektion av tagna bilder. När bilder har erhållits kan celler räknas antingen manuellt eller genom att använda något av flera programvarupaket, inklusive både gratis (t.ex. ImageJ, CellProfiler, etc) och kommersiell programvara (t.ex. Metamorph, Gen5, etc). Automatiserad cellräkning är i allmänhet att föredra eftersom korrekt utvecklade automatiserade cellräkningspipelines är mer exakta och mindre partiska än manuella räkningar. De också mer effektivt bortse cell skräp eller olösliga komplex. Utvecklingen av dessa rörledningar är i allmänhet okomplicerad och förenklas genom effektiviteten hos de fläckar som används. Utdata är kvantitativa eftersom det faktiska antalet döda celler beräknas automatiskt med avseende på totalt celltal, och olika tröskelvärden kan tillämpas för att öka eller minska strängheten för detektering35. För enkelhetens skull ingår optimerade parametrar för att räkna celler med hjälp av Gen5 v. 3.00-programkompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om protokollet för Hoechst/PI cytotoxicitet analys är robust och kräver jämförelsevis lite hands-on tid, det finns flera experimentella detaljer som är mycket viktiga för att säkerställa korrekta resultat. För det första är det väsentligt att se till att koncentrationen av DMSO förblir under 0,5% (v/v). Det är allmänt överens om att exponering för även låga doser av DMSO väsentligt kan förändra morfologi och fastsättning av celler och avsevärt fördröja cellcykelprogression<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, en CPRIT forskare i cancerforskning, tack cancerförebyggande och Research Institute of Texas (CPRIT) för deras generösa stöd, CPRIT bevilja RR150044. Detta arbete stöddes också av Welch Foundation Research Grant C-1930, och av National Institutes of Health R35 GM129294 tilldelas NVK. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller utarbetande av manuskriptet.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: “mitochondrial malignancy” and ROS-induced oncogenic transformation – why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
