Mätning efter stroke cerebral ödem, infarkt zon och blod -hjärnbarriär nedbrytning i en enda uppsättning gnagare hjärnprover

Summary

Detta protokoll beskriver en ny teknik för att mäta de tre viktigaste parametrarna för skandinavisk hjärnskada på samma uppsättning gnagare hjärnprover. Att bara använda ett hjärnprov är mycket fördelaktigt när det gäller etiska och ekonomiska kostnader.

Abstract

En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är ischemisk stroke. Historiskt sett innebär en djurmodell som används för att stimulera ischemisk stroke mellersta cerebral arteriell ocklusion (MCAO). Infarktzon, hjärnödem och blod- hjärnbarriärnedbrytning (BBB) mäts som parametrar som återspeglar omfattningen av hjärnskada efter MCAO. En betydande begränsning av denna metod är att dessa mätningar normalt erhålls i olika råtthjärnprover, vilket leder till etiska och ekonomiska bördor på grund av det stora antalet råttor som behöver avlivas för en lämplig provstorlek. Här presenterar vi en metod för att noggrant bedöma hjärnskada efter MCAO genom att mäta infarkt zon, hjärnan ödem och BBB permeabilitet i samma uppsättning råtta hjärnor. Denna nya teknik ger ett effektivare sätt att utvärdera strokens patofysiologi.

Introduction

En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är stroke. Globalt representerar ischemisk stroke 68% av alla strokefall, medan ischemisk stroke i USA står för 87% av^{strokefallen 1,2}. Det uppskattas att den ekonomiska bördan av stroke uppgår till 34 miljarder dollar i Förenta staterna² och 45 miljarder euro i Europeiska unionen³. Djurmodeller av stroke är nödvändiga för att studera dess patofysiologi, utveckla nya metoder för utvärdering och föreslå nya terapeutiska alternativ⁴.

Ischemisk stroke uppstår med ocklusion av en större cerebral artär, vanligtvis den mellersta cerebrala artären eller en av dess grenar⁵. Således har modeller av ischemisk stroke historiskt involverat mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12}. Efter MCAO, neurologisk skada bedöms oftast genom mätning av infarktzon (IZ) med hjälp av en 2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid (TTC) färgningsmetod¹³, hjärnödem (BE) med torr eller beräkna halvklotformade volymer^14,15,16, och blod hjärnbarriär (BBB) permeabilitet genom en spektroskopi teknik med Evans blå färgning^17,18,19.

Den traditionella MCAO-metoden använder separata uppsättningar hjärnor för var och en av de tre hjärnmätningarna. För en stor urvalsstorlek resulterar detta i ett betydande antal avlivade djur, med ytterligare etiska och ekonomiska överväganden. En alternativ metod för att lindra dessa kostnader skulle innebära mätningar av alla tre parametrarna i en enda uppsättning efter MCAO gnagare hjärnor.

Tidigare försök har gjorts att mäta kombinationer av parametrar i samma hjärnprov. Samtidiga immunofluorescerande^{färgningsmetoder 20} samt andra molekylära och biokemiska analyser²¹ har beskrivits efter TTC färgning i samma hjärnan prov. Vi har tidigare beräknat hjärnhalvvolymer för att bedöma hjärnan ödem och utfört TTC färgning för att beräkna infarkt zon i samma hjärna set¹⁵.

I det nuvarande protokollet presenterar vi en modifierad MCAO-teknik som mäter ischemisk hjärnskada genom att bestämma IZ, BE och BBB permeabilitet i samma uppsättning gnagare hjärnor. IZ mäts med TTC-färgning, BE bestäms genom beräkning av halvklotferisk volym och BBB permeabilitet erhålls med spektrometrimetoder¹⁹. I detta protokoll använde vi en modifierad MCAO-modell, baserad på direkt insättning och fixering av monofilamentkatetern i den inre halspulsådern (ICA) och ytterligare blockering av blodflödet till den mellersta cerebrala artären (MCA)²². Denna modifierade metod visar en minskad dödlighet och sjuklighet jämfört med den traditionella MCAO-metoden^16,22.

Detta nya tillvägagångssätt ger en ekonomiskt sund och etisk modell för att mäta neurologiska skador efter MCAO. Denna bedömning av de viktigaste parametrarna för skandinaviska hjärnan skada kommer att bidra till att grundligt undersöka dess patofysiologi.

Protocol

Följande förfaranden genomfördes i enlighet med rekommendationerna i Helsingfors och Tokyoförklaringen och riktlinjerna för användning av försöksdjur från Europeiska gemenskapen. Experimenten godkändes också av djurvårdskommittén vid Ben-Gurion University of the Negev. 1. Förbereda råttor för försöksförfarandet Välj vuxna manliga Sprague-Dawley råttor utan overt patologi, var och en väger mellan 300 och 350 g. Håll alla råttor i rumstemperatur vid 22…

Representative Results

Mätning av infarktzoner Ett oberoende t-test visade att 19 råttor som genomgick permanent MCAO visade en signifikant ökning av hjärnans infarktvolym jämfört med de 16 sham-operated råttorna (MCAO= 7,49% ± 3,57 jämfört med Sham = 0,31 % ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (se figur 2A)). Uppgifterna uttrycks som en genomsnittlig procentandel av den kontralaterala ± SD. Mätning av hjär…

Discussion

Huvudsyftet med detta protokoll var att påvisa konsekventa mätningar av tre huvudparametrar för ischemisk skada: IZ, BE och BBB permeabilitet. Tidigare studier på detta område har visat möjligheten att utföra en eller två av dessa parametrar tillsammans i samma urval. Förutom den kostnadsminskning som denna tredelad metod erbjuder ger den också en mer önskvärd bioetisk modell som begränsar antalet djur som måste opereras och därefter avlivas. Som i alla histologiska tekniker begränsas metoden av oförmåg…

Materials

2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus	Microsoft	–	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017