Изготовление биомиметического нано-матрицы с нанотрубок Janus Base и фибронектина для агезии стволовых клеток
Summary
Целью этого протокола является показать сборку биомиметического наноматрикса (NM) с нанотрубками Janus base (JBNTs) и фибронектином (FN). При совместной культуре с человеческими мезенхимальными стволовыми клетками (HMSCs), NMs обладают отличной биоактивностью в поощрении адгезии HMSCs.
Abstract
Биомиметический НМ был разработан в качестве ткани инженерии биологических эшафот, который может повысить якорь стволовых клеток. Биомиметический НМ образуется из JBNTs и FN через самосвечение в aqueous растворе. JBNTs измеряют 200-300 мкм в длину с внутренними гидрофобными полыми каналами и внешними гидрофильные поверхности. JBNTs положительно взимается и FNs отрицательно взимается. Таким образом, при введении в нейтральный aqueous решение, они связаны друг с другом через noncovalent связи для формирования NM расслоения. Процесс самос сборки завершается в течение нескольких секунд без каких-либо химических инициаторов, источника тепла или УФ-излучения. Когда рН раствора NM ниже, чем изоэлектрический пункт FNs (pI 5.5-6.0), NM пучки будут самостоятельно выпускать из-за наличия положительно заряженных FN.
NM, как известно, имитирует внеклеточной матрицы (ECM) морфологически и, следовательно, может быть использован в качестве инъекционных эшафот, который обеспечивает отличную платформу для повышения hMSC адгезии. Анализ плотности клеток и эксперименты по визуализации флуоресценции показали, что НМ значительно увеличили крепление ГМС по сравнению с отрицательным контролем.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки человека (ГМСЦ) показали потенциал для самооб обновления и самооценки по различным мезенхимальным линиям, что помогает в регенерации и поддержаниитканей 1. Основываясь на потенциале дифференциации, HMSCs рассматриваются в качестве кандидатов для мезенхимальных травм тканей и гематопоэтического расстройстватерапии 2. HMSCs показали способность содействовать заживлению ран путем увеличения восстановления тканей, ангиогенез, и снижение воспаления3. Однако, без биохимической помощи или биоматериалов, эффективность для HMSCs для достижения целевой ткани и функции в нужном месте является низким4. Хотя различные инженерии леса были использованы для привлечения HMSCs придерживаться на поражения, некоторые сайты, такие как рост перелом пластины, в середине длинной кости, не легко доступны по обычным сборных лесов, которые не могут идеально вписываться в неправильной формы раненых сайта.
Здесь мы разработали биомиметический наноматериал, который может самостоятельно собираться на месте и вводиться в труднодоступную целевую область. Инъекционные био-эшафот NM состоит из Janus базовых нанотрубок (JBNTs) и фибронектин (FN). JBNTs, также известный как розетки нанотрубки (RNTs), являются производными от ДНК базовых пар, в частности, тимин иаденин, здесь 5,6,7. Как видно на рисунке 1, нанотрубки образуются, когда шесть молекул производных пар базы ДНК самосберуются через водородные связи, чтобы сформироватьплоскость 6. Шесть молекул затем укладываются друг на друга в плоскости через сильное взаимодействие pi-укладки7, который может быть до 200-300 мкм в длину. JBNTs предназначены для морфологически имитировать коллагеновых волокон, так что FN будет реагировать с ними.
FN является высоким молекулярным весом клей гликопротеин, который можно найти во внеклеточной матрицы (ECM)9. Они могут одолеть присоединение стволовых клеток к другим компонентам ECM, особенно коллагена10. Мы разработали JBNTs для морфологически имитировать коллагеновые волокна, чтобы FN может реагировать с ними, чтобы сформировать НМ в течение нескольких секунд с помощью нековалентной связи. Таким образом, NM является перспективным био-эшафот, который будет введен в кости перелом сайта, которые не могут быть доступны по условно изготовленные леса. Здесь, инъекционные НМ представляет собой отличную способность для повышения hMSC якорь в пробирке, демонстрировали свой потенциал, чтобы служить в качестве леса для регенерации тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы разработали самосборный биомиметический НМ, который был сформирован с помощью ДНК-вдохновил JBNTs и FN. При подготовке решения JBNT лиофилизированный порошок JBNT должен растворяться в воде вместо PBS, потому что PBS вызовет агломерацию JBNTs, которая препятствует их сборке. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансово поддерживается NIH (Гранты 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Карьера премии (1653702) и Университета Коннектикута.
Materials
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O’Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. . U. S. Patent. , (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation – lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
