Proteolytiskt nedbrutna Alginate Hydrogels och Hydrophobic Mikrobioreaktorer för Porcine Oocyte Inkapsling

Summary

Presenteras här är två protokoll för inkapsling av porcin oocytes i 3D-kultur villkor. I den första, cumulus-oocyte komplex (COCs) är inkapslade i fibrin-algininate pärlor. I den andra är de inneslutna med fluorerade etylenpropylenpulverpartiklar (mikrobioreaktorer). Båda systemen säkerställer optimala förutsättningar för att behålla sin 3D-organisation.

Abstract

Inom reproduktionsbiologin ledde den biotekniska revolution som började med artificiell insemination och embryoöverföringsteknik till att det blev så att man kunde utveckla assisterad reproduktionsteknik som oocyte in vitro-mognad (IVM), provrörsbefruktning (IVF) och kloning av tamdjur genom kärnvapenöverföring från somatisk cell. IVM är metoden särskilt av betydelse. Det är plattformstekniken för leverans av mogna, högkvalitativa oocyter för tillämpningar som minskning av generationsintervallet i kommersiellt viktiga eller hotade arter, forskning om human reproduktion in vitro, och produktion av transgena djur för cellterapier. Termen oocyte kvalitet omfattar dess kompetens att slutföra mognad, befruktas, vilket resulterar i friska avkomma. Detta innebär att äggceller av god kvalitet är av största vikt för framgångsrik befruktning inklusive IVF förfaranden. Detta medför många svårigheter att utveckla en tillförlitlig odlingsmetod som skulle stödja tillväxten inte bara av mänskliga oocyter utan också av andra stora däggdjursarter. Det första steget i IVM är in vitro-kulturen av oocyter. Detta arbete beskriver två protokoll för 3D-kulturen av porcina oocytes. I den första, 3D-modell cumulus-oocyte komplex (COCs) är inkapslade i en fibrin-alginate bead interpenetrating nätverk, där en blandning av fibrin och alginat är gelled samtidigt. I den andra är COCs upphängda i en droppe medium och inkapslade med fluorerad etylenpropylen (FEP; en copolymer av hexafluorpropen och tetrafluoreten) pulverpartiklar för att bilda mikrobioreaktorer som definieras som Liquid Marbles (LM). Båda 3D-systemen upprätthåller den gasformiga in vitro-kulturens miljö. De upprätthåller också COCs 3D-organisation genom att förhindra deras utplaning och därav följande störningar av gap korsningar, och därmed bevara funktionella förhållandet mellan äggcell, och omgivande follikulära celler.

Introduction

Utvecklingen av olika kultursystem, inklusive tredimensionella (3D) sådana, syftar till att ge optimala förutsättningar för tillväxt och mognad av äggceller isolerade från folliklar även i tidigaste utvecklingsstadier. Detta är av stor betydelse för assisterad reproduktionsteknik (ART), särskilt med tanke på det ökande antalet kvinnor som kämpar med infertilitet efter cancerbehandling¹. Mognad av oocyter i in vitro-förhållanden (IVM) är redan en väletablerad teknik som huvudsakligen används för embryogenerering in vitro för ändamålet med boskapsreproduktion². Hos de flesta däggdjursarter, även om höga mognadstal av komplex av cumulus-oocyte (COCs) kan uppnås (intervall 60 till 90 %)³, är deras utvecklingskompetens dock fortfarande otillräcklig för behoven. Detta beror på att utvecklingen av zygoterna som erhålls på ett sådant sätt även upp till blastocyststadiet är låg och efter överföringen in i surrogatdjur deras livskraft att sikta minskas. Följaktligen finns det ett behov av att öka utvecklingskompetensen hos embryon som erhållits från oocyter som utsattes för IVM-förfarandet⁴. Därför är nya mognad media⁵ håller på att utformas och olika perioder av in vitro-kultur testas^6,7 tillsammans med tillskott av kultur medier med olika tillväxtfaktorer och molekyler^8,9.

Det första steget i alla kompletta IVM-system är att skapa optimala förutsättningar för hållbar tillväxt av äggceller under in vitro-kulturen. Ocyttillväxten är en av de specifika indikatorerna på äggcellens förmåga att återuppta meiosis^10,11. Dessutom måste ett lämpligt oocyte in vitro-odlingssystem kunna stödja dess kärnmognad och cytoplasmatiska differentiering¹². Morfologin i cumulus-oocyte komplexet är en annan viktig indikator som används i ART kliniker för att välja ut den bästa äggcell för efterföljande steg av in vitro-fertilisering (IVF) förfarande hos människor och boskap^12,13. Bland morfologiska egenskaper COCs beaktas är: den oocyte diameter, dess cytoplasma granulation och den första polarkroppen integritet^14,15. Förutom, den oocyte utvecklingspotential är korrelerad till utseende och kompaktering av cumulus celler och antalet av deras lager som omger äggcellen. Mycket viktigt för lämplig oocyte in vitro-odling systemet är också upprätthållandet av oocyt–cumulus celler korrekt interaktioner och cytoskelett stabilitet^16,17,18,19. Hittills har in vitro-oocytetillväxt inom humana COCs visats²⁰. Användningen av ko COCs resulterade också med levande födda. Dessa isolerades från omogna äggstocksfolliklar och sedan odlade i 14 dagar tills äggcellen var tillräckligt stor för att genomgå^{IVF-förfarandet 21}. På samma sätt gav COCs isolerade från babian antrala folliklar, utsätts ivm efter in vitro-kultur äggceller som kan återitiera meios till metafas II-stadiet med en normal visas spindel struktur²². Men i denna studie författarna inte försöka befrukta dem. Icke desto mindre tyder sådana resultat på att ett liknande förfarande skulle kunna tillämpas inte bara på dessa särskilda däggdjursarter utan även på humana cumulus-oocytekomplex som erhållits från folliklar vad som borde göra det möjligt att erhålla oocyter av god kvalitet som lämpar sig för en framgångsrik IVF-teknik.

De ovan beskrivna resultaten erhölls med tillämpning av konventionella IVM protokoll under vilka äggceller var odlade i tvådimensionella (2D) system. Rutinförfarandet i 2D-odlingssystem täcker oocyter, nedsänkt i en droppe av en lämplig kultur media, med mineralolja^23,24. Det antas att en olja overlay under in vitro-oocyte kultur tjänar till att förhindra vätskeavdunstning, vilket säkerställer upprätthållandet av korrekt pH och osmotiska trycket i kulturen. Även om en sådan 2D-odling system gör det möjligt att erhålla, även upp till 87% av mogna gris oocyter²⁵, har det bevisats att mineraloljan overlay orsakar betydande diffusion av lipidlösliga material som är nödvändiga för korrekt oocyter utveckling²⁶. Dessutom, på grund av steroider (progesteron och östrogener) diffusion i mineraloljan under äggcell kultur, en försening av nukleära mognad och minskning av utvecklingsmässiga kompetens uppnåendet av gris oocytes observerades. Detta kan resultera i att få ett litet antal zygoter, som dessutom kännetecknas av låg utvecklingskapacitet till scenen i blastocyst och av dålig livskraft efter överföring till mottagande djur²⁷. Därför görs försök att öka utvecklingsmässiga kompetensen hos embryon som härrör från äggceller som mottagits efter IVM förfarande, genom att skapa optimala förutsättningar för att uppnå både cytoplasmatiska och nukleära mognad av äggceller odlade tillsammans med CCs som komplex, särskilt med hjälp av tredimensionella (3D) system. Olika innovativa 3D in vitro-kultur system har utvecklats under de senaste två decennierna^28,29. Dessa var utformade för att upprätthålla den naturliga rumsliga organisationen av celler och för att undvika att de plattas i kulturrätter vad som inte kan uppnås i de traditionella 2D-kulturerna. Den strukturella och funktionella aktiviteten hos odlade COCs kan säkerställas genom upprätthållandet av deras rätta arkitektur och ostörda kommunikation genom gap-korsningar mellan olika^{fack 30}. Bio-byggnadsställningars lämplighet för 3D in vitro-odling av cumulus–oocytekomplex har utvärderats med hjälp av naturliga biomaterial som olika komponenter i den extracellulära matrisen (ECM; kollagen och hyaluronsyra)³¹ eller inerta polymerer (alginat)³². Dessa försök som testades i flera arter förde lovande resultat i form av oocyte meios återupptagande och uppnåendet av deras fulla kompetens^33,34,35. Hittills har dock inget 3D-system som är lämpligt för KOL-mognad som isolerats från stora husdjur, inklusive svin, utvecklats.

Detta arbete beskriver två protokoll som kan användas för 3D-kulturen av porcine COCs. Det första protokollet beskriver inkapsling i fibrin-alginatpärlor (FAB). FAB kan bildas genom samtidig blandning av en alginat- och fibrinlösning, som genomgår en synkron gelationsprocess. Denna kombination ger en dynamisk mekanisk miljö eftersom båda komponenterna bidrar till matrisstyvhet. En liknande lösning har använts tidigare för mus äggstocksfollikel kultur och mognad³⁶. När det gäller det presenterade protokollet, för att undvika för tidig nedbrytning av alginat-fibrinnätverket, används lämpligt högre koncentrationer av kalciumkloridlösning, vilket garanterar en snabb och stabil gelationsprocess. Den dynamiska mekaniska miljön skapar förhållanden som liknar dessa i den naturliga intra-follicular miljö där COCs bor och öka i storlek. Dessutom visar arbetet representativa resultat av COCs 3D-odlingssystem, där dessa är suspenderade i en droppe medium och inkapslade med fluorerad etylenpropen (FEP; en samofer av hexafluorpropen och tetrafluoreten) pulverpartiklar, för att bilda mikrobioreaktorer (Liquid Marbles, LM). LM är en form av 3D bioreaktor som tidigare har visat sig stödja, bland andra, tillväxt av levande mikroorganismer³⁷, tumör sfäroider³⁸ och embryonala stamceller³⁹. LMs har också framgångsrikt använts för får oocyte kultur⁴⁰. I de flesta experiment med hjälp av 1:ler framställdes bioreaktorer med hjälp av polytetrafluoreten (PTFE) pulverbädd med partikelstorlek på 1 μm⁴¹. Det presenterade protokollet använder FEP, som är mycket lik i sammansättning och egenskaper till fluorpolymererna PTFE. Men FEP är lättare formbar och mjukare än PTFE och vad som är särskilt viktigt, det är mycket transparent.

Båda 3D-systemen upprätthåller den gasformiga in vitro-kulturens miljö. De upprätthåller också COCs 3D-organisation genom att förhindra deras tillplattande och därav följande störningar av gap korsningar, bevara deras funktionella relation mellan äggcellen och omgivande follikulära celler.

Protocol

Följande förfaranden godkändes av djurskyddskommittén vid Institutet för zoologi och biomedicinsk forskning vid Jagiellonian University. 1. Isolering av komplex av svin cumulus-oocyte För att samla in material för isolering av äggstocksfolliklar, punktskatteosedoarries från prepubertala gylter (cirka 6-7 månaders ålder, väger 70 till 80 kg) på ett lokalt slakteri. Välj cirka 20 grisovaries från 10 djur för COCs isolering i varje experiment.NOTERA: Om man antar att…

Representative Results

I COCs som använder båda IVM-systemen, granulosacellerna vidhäftade tätt till varandra, och de flesta av de återvunna COCs hade intakta lager av cumulus celler (Figur 1A,B). Dessutom behölls en betydande andel av cumuluscellerna. De resultat som erhölls från KOL-analys genom lönsamhet bekräftade att båda systemen som tillämpades för inkapsling av porcina oocyter i 3D-in vitro-förhållanden säkerställde optimala tillväxtförhållan…

Discussion

Förmågan att upprätthålla in vitro-tillväxt inte bara av äggcellen utan även av cumulusceller som omger den och samtidigt stödja dess mognad är ytterst väsentlig för den framgångsrika assisterade reproduktionstekniken och för att främja förståelsen av somatiska cell/oocyte interaktioner speciellt hos arter som genomgår långvarig follikulär tillväxt såsom människor eller svin. Kontinuerligt förbättrad IVM tekniker blir användbart verktyg för att bevara reproduktiva alternativ i fall av polycystis…

Materials

General
Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml	Thermo Fisher	15240062	2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2)
DMEM/F12 (500ml)	Sigma-Aldrich	D8062	Handling and Maturation Medium
DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml	Thermo Fisher	14190144
FCS (100 ml)	Thermo Fisher	16140063	10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.)
PBS (1x, pH 7.4) 500ml	Thermo Fisher	10010023
TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml	Cayman Chemicals	600232	1x final concentration. Other brand can be use
Maturation Medium
hCG (1 VIAL of 10 000 U)	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG	BioVendor	RP1782721000
Fibrin-alginate beads
Alginate Lyase	Sigma-Aldrich	A1603	(Step 2.11.1)
Thrombin	Sigma-Aldrich	T9326-150UN	(Step 2.1)
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	(Step 2.1)
Fibrinogen (250mg)	Sigma-Aldrich	F3879	(Step 2.2)
Sodium Alginate	Sigma-Aldrich	W201502	(Step 2.3) use for alginate solution
Liquid Marble
FEP	Dyneon GmbH 3M AdMD	A-66670
Morphological examination
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher	L3224	(Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	mounting medium
Ultrastructure examination
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	2.5% final concentraion (Step 4.2.1.)
LR White resin	Sigma-Aldrich	L9774	(Step 4.2.4.)
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140	(Step 4.2.5.)
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	O5500	(Step 4.2.3.)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)
Uranyl Acetate	POCH	868540111	(Step 4.2.4.)
Specific instruments, tools
30 mm Pteri dish	TPP	93040
60 mm IVF Petri dish	Falcon	353653
Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor	RI Life Sciences	8-72-288
Ez-Tip	RI Life Sciences	8-72-4155/20
Heating Table	SEMIC		Other brands can be used
Incubator	Panasonic	MCO-170AIC-PE	Other brands can be used
Sterile petri dish (10 cm)	NEST Biotechnology	704002
Sterile syringe filters with 0.2 µm	GOOGLAB SCIENTIFIC	GB-30-022PES
Thermos	Quechua	5602589	Other brands can be used