脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節
Summary
Ex vivo脳スライスは、求心性入力に対する誘発反応に対する揮発性麻酔薬の効果を研究するために使用できます。光遺伝学は、視床皮質および皮質皮質求心性神経を非原発性新皮質に独立して活性化するために使用され、シナプスおよびネットワーク応答はイソフルランで調節されます。
Abstract
麻酔薬は、視床皮質回路に対する作用を介して意識に部分的に影響を及ぼします。しかし、揮発性麻酔薬がこれらの回路の明確な細胞およびネットワークコンポーネントにどの程度影響を与えるかは不明のままです。生体外脳スライスは、研究者が複雑なネットワークの個別のコンポーネントを調査し、誘発された反応に対する揮発性麻酔薬の影響の根底にある潜在的なメカニズムを解きほぐす手段を提供します。脳スライス中の潜在的な細胞タイプおよび経路特異的薬物効果を分離するには、研究者は求心性線維経路を独立して活性化し、重複しない細胞集団を特定し、揮発性麻酔薬を水溶液中の組織に適用できなければなりません。このプロトコルでは、ex vivo脳スライスにおける新皮質への2つの独立した求心性経路に対する光遺伝学的に誘発された応答を測定する方法が記載されている。細胞外応答はアッセイネットワーク活性に対して記録され、標的全細胞パッチクランプ記録はソマトスタチンおよびパルブアルブミン陽性介在ニューロンで行われます。細胞およびネットワーク応答を調節するための人工脳脊髄液を介した生理学的に関連する濃度のイソフルランの送達が記載されている。
Introduction
揮発性麻酔薬は、1世紀以上にわたってさまざまな臨床および学術環境で遍在的に使用されてきました。異なるクラスの麻酔薬は、独特の、しばしば重複しない分子標的1,2,3を持っていますが、それらのほとんどすべてが無意識を生み出します。それらの行動効果は非常に予測可能ですが、麻酔薬が意識喪失を誘発するメカニズムはほとんど知られていません。麻酔薬は、皮質視床回路上の作用を介して意識のレベルと内容の両方に最終的に影響を及ぼし、皮質階層全体の情報の統合を混乱させる可能性があります4,5,6,7,8,9。より広義には、コルチコ視床回路の調節は、実験的に10または薬理学的に11の変化した意識状態において役割を果たす可能性があり、睡眠12および意識の病態生理学的障害13,14にも関与し得る。
麻酔中の意識の喪失と回復の根底にあるメカニズムのとらえどころのないことは、細胞、ネットワーク、およびシステムレベルでの麻酔薬の非線形の相乗作用に部分的に起因する可能性があります15。イソフルランは、例えば、選択された脳領域16、17、18内の活動を抑制し、遠隔脳領域19、20、21、22、23間の接続性を損ない、経路特異的な様式でシナプス応答を減少させる24、25。.分子レベルからシステムレベルまで、麻酔薬のどの効果が意識喪失をもたらすために必要または十分であるかは不明である。非侵襲的技術を用いた意識の実質的な臨床調査19,20,26に加えて、実験家が意識的経験に従属する明確な細胞およびネットワークの相互作用を解きほぐそうとすることが重要です。
無傷の脳に見られる複雑な相互作用を単純化することにより、ex vivo脳スライスは、脳の動的システムの孤立した構成要素の研究を可能にします9。縮小スライス調製は、局所神経回路の比較的無傷の解剖学的構造の利点とin vitro操作の多様性を兼ね備えています。しかし、最近まで、方法論的制約により、脳スライスにおける長距離入力のシナプスおよび回路特性の研究が妨げられていました27,28。コルチコ視床線維路の曲がりくねった経路は、電気刺激によって独立した求心性経路の活性化をほとんど不可能にしました。
脳スライス製剤に対する麻酔薬の効果を調査することは、さらなる課題を提示する。無傷の呼吸器系および循環器系がない場合、麻酔薬を入浴させ、濃度を推定効果部位の濃度に注意深く一致させる必要があります。.多くの静脈内麻酔薬にとって、組織内の平衡化速度が遅いため、従来の薬理学的調査は面倒です29,30。ex vivo製剤中の揮発性ガス麻酔薬の効果を調査することは、より扱いやすいですが、課題もあります。これらには、吸入分圧用量を水性濃度に変換すること、および人工脳脊髄液31を介した組織への薬物の修正送達システムの必要性が含まれる。
ここでは、研究者が揮発性麻酔薬イソフルランの十分に文書化された物理化学的特性を利用して、ex vivo脳スライスへの薬物送達を行い、高い時空間分解能で皮質領域への経路および層特異的入力を活性化し、同時に実施する方法について説明します 層流記録と標的パッチクランプ記録 ニューロンの選択された集団から。これらの手順を組み合わせることで、研究者は、シナプスレベルからローカルネットワークレベルまで、いくつかの観察可能な電気生理学的応答特性における揮発性麻酔薬誘発性の変化を測定できます。
Protocol
このプロトコルに記載されている動物を含むすべての手順は、ウィスコンシン大学マディソン医学部および公衆衛生動物管理および使用委員会によって承認されました。 1. 介在ニューロン亜集団で蛍光レポータータンパク質を発現させるマウスの繁殖 ホモ接合性のCre依存性tdTomato雄マウスを、ホモ接合型SOM-Cre雌マウスまたはホモ接合型PV-Cre雌マウスのいずれかと…
Representative Results
プロトコルで説明されている手順のタイムラインを 図 1 に示します。高次皮質領域または非一次視床核から到着する皮質入力は、非一次視覚野24の層1で部分的に重複する終末野を有する。独立した視床皮質または皮質皮質求心性経路を単離するために、ChR2およびeYFP蛍光レポーターを含むウイルスベクターをPoまたはCgのいずれかに注入した。注射半径…
Discussion
この原稿では、ex vivo脳スライスにおいて選択的に活性化された求心性経路に対する細胞内および細胞外の応答を評価するためのプロトコルが記載されている。
光遺伝学的ツールと並列記録スキームの使用により、研究者は、遠隔脳領域からの求心性入力に対する局所集団の応答を調査し、同時に介在ニューロンの標的集団から記録することができます。光遺伝学的技術?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、このプロジェクトに関する技術サポートとガイダンスを提供してくれたBryan Krauseに感謝します。
この研究は、国際麻酔研究学会(IMRAからAR)、国立衛生研究所(R01 GM109086からMIB)、およびウィスコンシン大学マディソン校の医学部および公衆衛生学部麻酔科の支援を受けました。
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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Cite This Article
Murphy, C. A., Raz, A., Grady, S. M., Banks, M. I. Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics. J. Vis. Exp. (161), e61333, doi:10.3791/61333 (2020).