Syftet med denna studie var att utveckla en murine modell av bränna sårläkning. En termisk brännskada inducerads på dorsala huden på möss med hjälp av en förvärmd mässing mall. Brända vävnad var debrided och överlagrad med en hud ympkvisten skördas från svansen av en genetiskt liknande givare mus.
Triviala ytliga sår läker utan komplikationer genom primära avsikt. Djupa sår, såsom full tjocklek brännskador, läka genom sekundär avsikt och kräver kirurgiska debridement och hud ympning. Framgångsrik integration av givaren moderplantor i en mottagare sår säng beror på snabb rekrytering av immunceller, robust angiogenic svar och nya extracellulära matris bildning. Utvecklingen av nya terapeutiska medel, som riktar sig till några viktiga processer som är involverade i sårläkning, hindras av bristen på tillförlitliga prekliniska modeller med optimerad objektiv bedömning av sårstängning. Här beskriver vi en billig och reproducerbar modell av experimentell full tjocklek bränna sår rekonstrueras med en allogen hud moderplantor. Såret induceras på dorsumytan av sövda inavlade vilda möss av vilda typer från BALB/C- och SKH1-Hrhr-bakgrunderna. Brännningen produceras med hjälp av en mässingsmall som mäter 10 mm i diameter, som är förvärmd till 80 °C och levereras vid ett konstant tryck i 20 s. Bränneschar strukits 24 timmar efter skadan och ersätts med en full tjocklekstransplantat som skördats från svansen på en genetiskt liknande givarmus. Ingen specialiserad utrustning krävs för ingreppet och kirurgiska tekniker är enkla att följa. Metoden kan enkelt implementeras och reproduceras i de flesta forskningsmiljöer. Vissa begränsningar är associerade med modellen. På grund av tekniska svårigheter är skörden av tunnare hudtransplantat med delad tjocklek inte möjlig. Den kirurgiska metod vi beskriver här möjliggör återuppbyggnad av bränna sår med full tjocklek huden ympkvistar. Det kan användas för att utföra prekliniska terapeutiska tester.
Kirurgisk debridement och hudympning är vanliga kliniska metoder som används vid hantering av kroniska sår1,brännskador2, och akuta sår såsom traumatiska sår3. Hudtransplantation hänvisar till det kirurgiska ingreppet, vilket innebär avlägsnande av frisk hud från en del av kroppen och överföra den till en annan. Givaren ympkvistar ersätta den förlorade vävnaden och ger en strukturell byggnadsställning för cellulärmigration och tillväxt. Efter integrering i mottagarplatsen ersätter hudtransplantat den förlorade hudbarriären genom att ge skydd mot mikrobiell invasion, skadliga effekter av den yttre miljön och överdriven förlust av fukt4. Framgångsrik hudtransplantat integration beror på flera faktorer. Dessa inkluderar adekvata immunsvar i närvaro av mikrobiella infektioner och snabb upplösning av inflammation, robust angiogenes vid sårplatsen och etablering av vaskulär anastomoser mellan mottagarbädden och donatortransplantatet5. När transplantatet börjar försämras måste inhemska dermalceller ersättas med celler som kan producera ny extracellulär matris. Samtidigt måste epidermal keratinocyterna krypa över den nyproducerade matrisen för att bilda neo-epidermis och åter epitelialisera såret. Det är därför uppenbart att effektiv migration av celler från mottagarbädden i donatortransplantatet är en annan avgörande faktor som påverkar framgångsrik graft incorporation. Med tanke på det stora antalet faktorer som är inblandade i sårläkning6, som kan vara omöjligt att kontrollera i de mänskliga prövningarna på grund av etiska begränsningar, modeller av prekliniska experimentella huden ympning är nödvändiga. Utveckling av prekliniska modeller av bränna sårläkning och tillhörande huden ympning kommer att vara viktigt för förståelsen av komplexa mekanismer som deltar i testning vävnad reparation och viktigt för testning av nya terapeutiska medel. In vitro-modellerna av sårläkning kan inte exakt efterlikna komplexiteten i den kutana vävnaden. Djurmodellerna in vivo är ett oumbärligt utredningsverktyg för att förstå de mekanismer som är involverade i vävnadsreparation.
Flera metoder för hud ympning teknik har utvecklats hos gnagare för att efterlikna kirurgiska excision och bränna sår återuppbyggnad7,8,9. De flesta av de tidigare beskrivna förfarandena misslyckades dock inte att framkalla en termisk bränna skada före huden ympning. Istället för bränna såret, en full tjocklek excisional sår inducerades, som sedan rekonstruerades med en full tjocklek hud allograft7. Olika anatomiska landmärken som öra, svans och rygg har använts för skörd av donatorhuden hos gnagare7,8. Olika graft fixering och stabilisering tekniker rapporterades, inklusive en “ingen sutur teknik”9, suturer7 och kirurgiskt lim10,11,12.
Syftet med denna studie var att utveckla en murine modell av en full tjocklek bränna sår som skulle rekapitulera den nuvarande guldstandard strategi i bränna behandling, vilket innebär nonviable vävnad excision och huden ympning. En termisk brännskada inducerads på dorsum ytan av en mus med hjälp av en förvärmd mässing mall. Bränneschar var strukits och ersättas med en full tjocklek ympkvist skördas från svansen på en givare mus. Det finns tre viktiga fördelar med denna experimentella modell. För det första kan mer än ett brännsår induceras på baksidan av mottagarmusen, och fyra donatorhudstransplantat kan skördas från en enda svans av givarmusen. Detta innebär att flera experimentella behandlingar och kontrollbehandlingar potentiellt kan jämföras med samma mottagare och donatordjur. Beroende på önskad administreringsväg kan kontrollbehandlingen omfatta lokal eller systemisk administrering av fordonet eller placebokontroll (t.ex. topikal applicering av salva, subkutan, intraperitoneal eller intravenös injektion av lösningen). För det andra kan tidpunkten för behandlingen och effektmåttet för experimentet kontrolleras. För det tredje, denna modell beror på återuppbyggnaden av sår med full tjocklek ympkvistar skördas från svansen, som är kända för att ha en högre sannolikhet för framgångsrik införlivande i givaren webbplats jämfört med huden skördas från baksidan13. Detta kan bero på det lägre antalet epidermal Langerhans celler, som spelar en nyckelroll i testning immunbiologi, och är associerade med huden transplantat avstötning14.
Den föreslagna modellen för sårläkning och transplantat integration kan mycket väl tillämpas på transgena och knockout möss. Användningen av genetiskt modifierade möss kommer att bidra till att belysa de roller som vissa gener kan spela under sårreparationer. Exogen tillämpning av aktuella sårpreparat eller subkutan administrering av terapeutiska antikroppar på skadeplatsen kan också övervägas.
På grund av tekniska svårigheter är split thickness hudtransplantat bestående av epidermis och en del av dermis svåra att få hos möss. Full tjocklek huden ympkvistar bestående av epidermis och full tjocklek dermis är kända för att kräva en väl vascularized sår säng för framgångsrik integration. Oförmågan att skörda hudtransplantat med delad tjocklek hos möss kan betraktas som en begränsning av denna modell. Fixering av hudtransplantatet till mottagarsåret sängen uppnåddes via tillämpning av det kirurgiska limmet, vilket är förknippat med mindre trauma och snabb nedbrytning jämfört med andra sätt att vävnad fixering15. Tidigare studier har visat att suturering är associerad med starkare vävnadfixering än det kirurgiska limmet vid 24 timmar efter det kirurgiska ingreppet15, vilket kan betraktas som en nackdel för förfarandet. Vid senare tidpunkter blir dock den biomekaniska styrkan hos sår som behandlats med ett kirurgiskt lim jämförbar med suturer15 och bättre än häftfixering16. Efter vävnadfixering med det kirurgiska limmet måste såren täckas med ett sårförband. Även sår på den dorsala ytan av musen är svåra för djuret att nå, såret dressing, å andra sidan, är lätt för djuret att manipulera och ta bort. Frekventa sårförbandsbyten kan vara motiverade.
Anestesi-inducerad hypotermi hos små gnagare är ett väldokumenterat fenomen17. Hypotermi är en bieffekt av detta förfarande, som orsakar komplikationer, och potentiellt äventyrar både djurhälsa och datakvalitet. Därför motiverar denna metod genomförandet av temperaturhanteringsstrategier, särskilt om hårlösa SKH1-Hrhr används.
Den viktigaste begränsningen av att använda möss för att efterlikna mänskliga sår stängning är skillnaden mellan hudens anatomi och fysiologi. Mussåren läker mestadels via kontraktion, medan mänskliga sår läker genom granulering vävnadsbildning och åter epitelialisering18. För att ta hänsyn till denna diskrepans kan den aktuella modellen modifieras och användas i kombination med en splintingring tätt faststämd runt såret för att förhindra hudkontraktion19. Med tanke på vissa fördelar och nackdelar med detta in vivo-protokoll, denna modell skulle kunna fungera som ett verktyg för att studera vissa processer som deltar i sårläkning som är omöjliga att studera in vitro.
Enligt tjockleken klassificering av bränna skada23, full tjocklek brännskador kännetecknas av uppenbara inblandning av hela tjockleken på huden och viss del av den subkutana vävnaden. Denna typ av sår kan läka endast genom kontraktion eller med hud ympning2. En inneboende begränsning av den metod som beskrivs i denna artikel är att endast full tjocklek ympkvistar, i motsats till delad tjocklek ympkvistar, som ofta används i den kliniska inställningen, skördades från svansen på en mus. Detta berodde på den tekniska svårigheten, eftersom musen huden är för tunn för att få delad tjocklek ympkvistar. Det måste påpekas att full tjocklek ympkvistar kräver en väl vascularized sår säng, medan delad tjocklek hudtransplantat kan överleva på givaren platser med mindre vaskularitet24. Tidigare studier visade att ett brännsår som inducerats på baksidan av musen var förknippat med en robust bildning av ny vaskulatur5. Detta tyder på att en väl vascularized område, såsom dorsum av musen, kan betraktas som den anatomiska landmärke för induktion av brännskador.
Bränn sårdjup är en viktig faktor att tänka på. Djupet på bränna såret måste vara konsekvent mellan enskilda möss. Reproducerbarheten av bränna sårdjup beror på temperaturen på mässing mallen, tryck och varaktighet av värmeexponering. Brännsårets djup måste verifieras histologiskt. Det är viktigt att komma ihåg att överdrivet tryck eller långvarig exponering av huden till den förvärmda mässing mallen kan skada den underliggande vävnaden. Vävnaden som omger ryggraden, inklusive komponenterna i det centrala och perifera nervsystemet, är känsliga för värme, och om den skadas kan resultera i bakbenförlamning.
Även om ingen postoperativ dödlighet var direkt förknippad med det kirurgiska ingreppet, ett litet antal hårlösa SKH1-Hrhr möss, som är särskilt känsliga för kyla, utvecklat hypotermi och misslyckades med att återhämta sig efter den allmänna anestesi. Därför måste extra värme tillhandahållas under alla estetiska händelser och konstant övervakning krävs medan musen sövs.
Den metod som beskrivs i denna studie var inte associerad med kirurgiska webbplats infektion. Aseptisk teknik måste dock användas för att förhindra överföring av mikroorganismer till det kirurgiska såret under perioperativa perioden. Inokulering av såret med bioluminescerande eller fluorescerande mikroorganismer kan införlivas i förfarandet. Denna teknik kan vara användbar vid studier av smittsamma organismer och deras patogenes25. Exogen tillsats eller injektion av bioluminescerande bakterier kan till exempel tillåta övervakning av den mikrobiella bördan med hjälp av in vivo hela djur imaging25. Med tanke på att mushår är känt för att störa in vivo hela djur fluorescens och bioluminescens imaging, hårlösa SKH1-Hrhr möss är idealiska värdar för studier med fluorescerande eller bioluminescerande reportrar.
Sårvävnadsprover kan samlas in vid olika tidpunkter och bearbetas för histologiska och immunohistokemiska analyser. Protein och RNA kan isoleras från hudbiopsi och molekylärbiologiska tekniker kan användas för att bedöma uttrycket av viktiga molekyler som är involverade i sårläkning.
I den aktuella studien beskrev vi en experimentell modell av bränna sårläkning och allogen hud engraftment. Detta förfarande kan ändras och fungera som en modell för prekliniska studier.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense och École Polytechnique. Vi tackar vår kollega Yann Plantier från École Polytechnique som gav insikt och expertis som i hög grad hjälpte till med produktionen av videofilen. Författarna tackar Benoit Peuteman och Charlotte Auriau från INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif för deras djurvälbehållning och omsorgsexpertis som tillhandahölls under projektets gång.
1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' – 0,45 X 12mm |
96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
Depilating cream | Veet | ||
Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
Heating pad | Petelevage | 120070 | |
Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
Ocrygel | Tvm France | ### | |
Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |