항생제 치료 모기를 가진 세균성 구강 먹이 분석
Summary
이 문서는 모기 midgut 경작 미생물의 격리 및 식별, 모기 창자 박테리아의 항생제 고갈을 포함하여 개별 모기 창자 박테리아의 효력을 조사하고, 1개의 특정 박테리아 종을 재소개하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
모기 midgut 호스트 신진 대사에 영향을 미치는 매우 동적 미생물군유전체를 항구, 재생, 피트 니스, 그리고 벡터 능력. 연구 는 창 자 미생물의 효과 전체적으로 조사 하기 위해 실시 되었습니다.; 그러나, 다른 미생물 호스트쪽으로 뚜렷한 효력을 발휘할 수 있었습니다. 이 문서는 각 특정 모기 창 자 미생물및 잠재적인 기계장치의 효력을 연구하는 방법론을 제공합니다.
이 프로토콜에는 두 부분이 포함되어 있습니다. 첫 번째 부분은 모기 midgut를 해부하는 방법을 소개합니다, 재배 박테리아 식민지를 분리하고, 박테리아 종을 확인하는 방법. 두 번째 부분은 항생제 처리된 모기를 생성하고 1개의 특정 박테리아 종을 다시 소개하는 절차를 제공합니다.
Introduction
모기는 Zika 바이러스, 뎅기열 바이러스 및 플라스모듐 기생충1을포함하여 백 개의 병원체를 통해 전송하는 인간 병원성 질병의 가장 중요한 벡터로 간주됩니다. 모기가 외란에 대한 영양분을 얻기 위해 혈액 식사를 할 때, 그들은 실수로 소화관을 통해 감염된 호스트에서 병원균을 섭취 할 수있습니다 2. 중요한 것은, 혈액 식사 소화와 병원체 입구 둘 다에 있는 중추적인 역할을 하는 모기 midgut는, 높게 다이내믹한 microbiome3를항구합니다.
여러 연구는 배양 의존적 방법 또는 박테리아 염기서열 분석4,,5,,6을사용하여 실험실 사육 및 현장 수집 모기 미생물을 특징으로한다. 판토에아, 세라티아, 클레브시엘라, 엘리자베스키아, 엔테로코커스를 포함한 종은 다양한 연구에서 모기로부터 일반적으로 분리된다5,,7,,8,,9. 흥미롭게도, 모기 장 내 미생물은 발달 단계, 종, 지리적 기원 및 수유 행동4에의해 영향을 받는 지역 사회의 다양성과 박테리아 종의 양 모두에서 동적으로 변동한다. 연구에 따르면 혈액 공급은 Enterobacteriaceae에서 종의 급속한 확장과 전반적인 다양성10,,11의감소와 함께 총 세균 부하를 극적으로 증가시킨다. 또한, 애벌레 단계의 모기 장내 미생물은 일반적으로 곤충이 새끼와 백과 기 전에 변형을 겪을 때 근절된다; 따라서 새로 등장한 성인 모기는 미생물4를다시 채워야 합니다.
장내 미생물은 영양 흡수, 면역, 발달, 번식 및 벡터역량(12)을포함한 다양한 측면에서 곤충 생리학을 조절한다. 악악 모기 유충은 박테리아 구강 공급이 발달하는 동안 첫 번째 인스타 를 넘어 개발하지 못하며, 이는 모기 장내 미생물이 애벌레 발달에 필수적임을 나타낸다13,,14. 게다가, 창 자 박테리아의 고갈 혈액 식사 소화 및 영양 흡수를 지연, oocyte 성숙에 영향을 미치는, 그리고 oviposition감소 15. 또한, 장내 미생물을 가진 모기는 항생제 처리한 모기에 비해 더 높은 면역 반응을 유도하고,16을감염시키기 위하여 그밖 병원체에 대하여 지속적으로 상승된 항균 펩티드 발현을 가진. 항생제는 일반적으로 이러한 연구에서 팬 창 자 박테리아를 제거 하기 위해 구두 관리, 다음 실험 은 축 축 모기와 모기와 대학 미생물의 차이 비교 하기 위해 실시. 그러나, 모기 midgut는 세균의 다양한 지역 사회를 항구하고, 각 박테리아 종은 호스트 생리학을 향해 명백한 효력을 발휘할 수 있었습니다.
모기 미생물은 다양한 효과로 벡터 역량을 조절합니다. 뎅기열 의 필드 유래 모기로부터 분리된 프로테우스에 의한 식민지화는 뎅기열 바이러스 감염에 대한 조절된 항균 펩티드 발현 및 저항을 부여한다16. 내모병원성 곰팡이 보베리아 bassiana는 arbovirus 감염에 대하여 통행료 및 JAK-STAT 면역 통로를 활성화합니다17. 대조적으로, Aedes aegypti midgut에서 분리된 곰팡이 탈라로미세스는 창자 트립신활동(18)을조절하여 뎅기열 바이러스 감염을 용이하게 한다. 또한, 세라티아 마르케센은 19모기의 장 상피에 있는 뮤신 층을소화하는 SmEnhancin에게 불린 분비 단백질을 통해 arbovirus 전송을 승진시다.
이 절차는 모기 미드구트의 해부, 재배 가능한 박테리아 식민지의 격리, 박테리아 종의 식별 및 구강 수유를 통한 재도입을 위한 체계적이고 직관적인 방법을 제공합니다. 그것은 모기 난소 발달 및 oviposition에, commensal 박테리아, Chryseobacterium meningosepticum와혈액 공급의 대표적인 결과를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
숙주 세균 상호 작용에 대 한 연구는 다른 창 자 미생물 다양 한 메커니즘을 통해 그들의 호스트 생리학에 영향을 발견. 이 기사에서는 모기 미드구트 해부, 재배장 세균 배양, 항생제 치료, 관심 있는 박테리아 재도입 등 모기 장내 미생물의 각 역할을 조사하는 방법을 소개합니다.
성공적인 항생제 치료를 위해, 다음과 같은 세부 사항은 실험을 수행에서 고려되어야한다. 본 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81902094, 81600497)과 후난성 과학 기술 계획 프로젝트(2019RS1036)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
