मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पूरे माउस आंखों का पाचन
Summary
यह प्रोटोकॉल मोनोसाइट्स, माइक्रोग्लिया, मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं सहित विशिष्ट नेत्र मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइटिक आबादी की पहचान करने के लिए बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के उद्देश्य से एक एकल कोशिका निलंबन में पूरी आंखों को पचाने की एक विधि प्रदान करता है।
Abstract
जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली यूवेइटिस, मधुमेह रेटिनोपैथी, और उम्र से संबंधित मैकुलर अध: पतन सहित नेत्र रोगविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं, विशेष रूप से मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स, ओवरलैपिंग सेल सतह मार्कर व्यक्त करती हैं, जो इन आबादी की पहचान करना एक चुनौती बनाती है। बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री माउस आंखों में मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, माइक्रोग्लिया और डेंड्रिटिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए कई सेल सतह मार्कर के एक साथ, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल पूरे माउस आंखों के परमाणु, नेत्र विच्छेदन, एक एकल कोशिका निलंबन में पाचन, और माइलॉयड सेल मार्कर के लिए एकल कोशिका निलंबन के धुंधला का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, हम एकल रंग नियंत्रण का उपयोग करके वोल्टेज का निर्धारण करने और फ्लोरेसेंस माइनस वन नियंत्रण का उपयोग करके सकारात्मक फाटकों को चित्रित करने के लिए उचित तरीकों की व्याख्या करते हैं। बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री की प्रमुख सीमा ऊतक वास्तुकला की अनुपस्थिति है। इस सीमा को व्यक्तिगत नेत्र डिब्बों या मानार्थ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा दूर किया जा सकता है। हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस मात्रात्मक विश्लेषण की कमी और अधिकांश माइक्रोस्कोप पर फ्लोरोफोरस की कम संख्या से सीमित है। हम लेजर-प्रेरित कोरोइडल नियोवैस्कुलराइजेशन में मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स का अत्यधिक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करने के लिए बहु-पैरामेट्रिक फ्लो साइटोमेट्री के उपयोग का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग ट्रांस्टोमिक या प्रोटेओमिक अध्ययन के लिए मैक्रोफेज सबसेट, भाग्य मानचित्रण और सेल छंटाई की पहचान के लिए किया जा सकता है।
Introduction
जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में कई सेल प्रकार शामिल हैं जो पूरक सक्रियण और सूजन को प्रोत्साहित करते हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं, मस्तूल कोशिकाएं, बासोफिल, इओसिनोफिल, न्यूट्रोफिल और मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स शामिल हैं। मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स, जो मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं से बना होते हैं, को यूवेइटिस, डायबिटिक रेटिनोपैथी और उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी)1सहित कई नेत्र स्थितियों के रोगविज्ञान में फंसाया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम नियोवैस्कुलर एएमडी2के माउस मॉडल में बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स की पहचान पर ध्यान केंद्रित करेंगे। यह प्रोटोकॉल मधुमेह रेटिनोपैथी और/या यूवेइटिस के माउस मॉडल के लिए अनुकूलनीय है, लेकिन इन बीमारियों की प्रणालीगत प्रकृति के कारण अधिक व्यापक नेत्र विच्छेदन की सिफारिश की जाती है ।
मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स सेल सतह मार्कर को ओवरलैपिंग व्यक्त करते हैं। लंबे समय तक चलने वाले ऊतक निवासी मैक्रोफेज और माइक्रोग्लिया जर्दी सैक-व्युत्पन्न एरिथ्रोमायलॉइड जनक3से उत्पन्न होते हैं, जबकि मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाओं को रीसाइक्लिंग बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज डेन्ड्रिटिक सेल जनकिटर4से अलग करता है। माउस सेल सतह मार्कर मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, और डेंड्रिटिक कोशिकाओं के लिए आम सीडी 45, सीडी 11बी5,F4/806,Cx3cr17,और इंट्रासेलुलर मार्कर Iba18शामिल हैं। इस चुनौती से उबरने के लिए, कई ऊतकों से मैक्रोफेज, मोनोसाइट्स और डेंड्रिटिक कोशिकाओं का ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण सीडी 64 को मैक्रोफेज-विशिष्ट कोशिका सतह मार्कर6के रूप में परिभाषित करता है। स्वस्थ आंखों में आईरिस, कोरॉइड, सिलियरी बॉडी और ऑप्टिक नर्व में मैक्रोफेज का वर्णन किया गया है3। वैकल्पिक रूप से, डेंड्रिटिक सेल पहचान अधिक कठिन है; डेंड्रिटिक सेल आइडेंटिफिकेशन की सबसे विशिष्ट विधि Zbtb46-GFP रिपोर्टर माउस9का उपयोग कर भाग्य मानचित्रण की आवश्यकता है . इस रिपोर्टर लाइन से स्वतंत्र, CD64 की अनुपस्थिति के साथ संयोजन के रूप में CD11c और MHCII की अभिव्यक्ति संभावित डेंड्रिटिक कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं6,10। डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं की पहचान कॉर्निया, कंजक्टिवा, आइरिस और सामान्य आंखों में कोरॉइड में की गई है11। माइक्रोग्लिया रेटिना में स्थित विशेष मैक्रोफेज हैं, जो रक्त-रेटिना बाधा द्वारा संरक्षित हैं, और जर्दी थैली जनक कोशिकाओं से12प्राप्त होते हैं। नतीजतन, रेटिना माइक्रोग्लिया को सीडी 45 अभिव्यक्ति13 और Tmem119 के उच्च स्तर के अपने मंद स्तर से मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से अलग किया जा सकता है, जो एक प्रवाह साइटोमेट्री एंटीबॉडी14के रूप में उपलब्ध है। माइक्रोग्लिया सक्रियण पर, हालांकि, सीडी 45 को विनियमित किया जा सकता है15 और Tmem119 नीचे विनियमित3हो सकता है, माइक्रोग्लिया जीव विज्ञान की जटिलता का प्रदर्शन करता है और यह एएमडी और इसके माउस मॉडल दोनों में प्रासंगिक होने की संभावना है। अंत में, मोनोसाइट्स को शास्त्रीय और गैर-शास्त्रीय सहित कम से कम दो उपप्रकारों में विभाजित किया जा सकता है। शास्त्रीय मोनोसाइट्स प्रदर्शन CCR2+Ly6Cउच्चCX3CR1कम अभिव्यक्ति, और गैर शास्त्रीय मोनोसाइट्स CCR2-Ly6CकमCX3CR1उच्च मार्कर5प्रदर्शित करता है ।
मार्कर अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण की आवश्यकता के कारण, यानी, उच्च बनाम कम/मंद स्तर, बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, माइक्रोग्लिया, और आंखों और अन्य ऊतकों में डेंड्रिटिक कोशिकाओं के बीच भेदभाव के लिए आदर्श तरीका है। अतिरिक्त लाभों में उप-आबादी की पहचान, ट्रांसक्रिप्टोमिक या प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए सेल आबादी को सॉर्ट करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करने की क्षमता, और भाग्य मानचित्रण शामिल हैं। मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री का प्रमुख नुकसान ऊतक वास्तुकला की कमी है। कॉर्निया, कंजक्टिवा, आईरिस, लेंस, रेटिना, और कोरॉइड-स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स: यह विभिन्न नेत्र उपविभाग में नेत्र विच्छेदन से दूर किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पुष्टित्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग किया जा सकता है, लेकिन मार्कर की संख्या और मजबूत मात्रा की कमी से सीमित है।
जीनोम वाइड एसोसिएशन अध्ययनों ने एएमडी16के साथ कई पूरक जीनों को जोड़ा है। पूरक सक्रियण एनाफिलाटॉक्सिन उत्पादन, ल्यूकोसिटे भर्ती और परिणामी सूजन की ओर जाता है। पूरक रिसेप्टर की कमी वाले चूहों में, लेजर चोट मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट भर्ती और लेजर-प्रेरित कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) क्षेत्र17को कम कर देती है। इसी तरह, सी-सी आकृति केमोकीन रिसेप्टर 2 (CCR2) नॉकआउट माउस, जो ऊतक के लिए मोनोसाइट भर्ती में कमी है, दोनों को दर्शाता है मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट भर्ती और लेजर प्रेरित सीएनवी क्षेत्र18। ये डेटा पूरक और मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स को प्रायोगिक सीएनवी और संभवतः नियोवैस्कुलर एएमडी के साथ जोड़ते हैं। इस संघ के समर्थन में, पूरक रिसेप्टर्स को नियोवैस्कुलर एएमडी19,20के रोगियों में परिधीय रक्त मोनोसाइट्स पर डीसिलेट किया जाता है। ये डेटा एएमडी और मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स के बीच एक मजबूत संबंध प्रदर्शित करते हैं।
इस पांडुलिपि में, हम प्रयोगात्मक लेजर प्रेरित सीएनवी मॉडल का उपयोग बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके माउस आंख में मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट आबादी की विशेषता के लिए करेंगे। लेजर-प्रेरित सीएनवी नियोवैस्कुलर एएमडी का मानक माउस मॉडल है, जिसने वर्तमान पहली पंक्ति नियोवैस्कुलर एएमडी थेरेपी21की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया। यह प्रोटोकॉल माउस आंखों के नाभिक, नेत्र विच्छेदन, एक एकल कोशिका निलंबन में पाचन, एंटीबॉडी धुंधला, एकल रंग नियंत्रण का उपयोग करके लेजर वोल्टेज का निर्धारण, और फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण का उपयोग करके गेटिंग रणनीति का वर्णन करेगा। लेजर-प्रेरित सीएनवी मॉडल के विस्तृत विवरण के लिए, कृपया पिछले प्रकाशन22देखें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम माइक्रोग्लिया, मोनोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाओं और मैक्रोफेज आबादी को परिभाषित करेंगे। इसके अलावा, हम लेजर प्रेरित CNV मॉडल के भीतर मैक्रोफेज सबसेट को आगे परिभाषित करने के लिए MHCII और CD11c का उपयोग करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
बहु-पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री एक जटिल ऊतक में कई सेल प्रकारों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस रिपोर्ट में, हम माउस आंख में लेजर चोट के बाद मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट आबादी के प्रवाह स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जल को एनआईएच अनुदान K08EY030923 द्वारा समर्थित किया गया था; सीएमसी को एनआईएच नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल डिजीज और ल्यूपस रिसर्च एलायंस से एक उपन्यास रिसर्च ग्रांट (637405) से K01 अनुदान (5K01AR060169) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
