Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten
Summary
Dieses Protokoll bietet eine Methode, um ganze Augen in eine einzelzellige Suspension zum Zweck der multiparametern Flow-Zytometrie-Analyse zu verdauen, um spezifische mononukleäre phagozytische Populationen zu identifizieren, einschließlich Monozyten, Mikroglia, Makrophagen und dendritischen Zellen.
Abstract
Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle in der okulären Pathophysiologie, einschließlich Uveitis, diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration. Angeborene Immunzellen, insbesondere mononukleäre Phagozyten, exprimieren überlappende Zelloberflächenmarker, was die Identifizierung dieser Populationen zu einer Herausforderung macht. Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die gleichzeitige, quantitative Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker, um Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritische Zellen in Mausaugen zu unterscheiden. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation ganzer Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine einzellige Suspension und die Färbung der einzelzelligen Suspension für myeloische Zellmarker. Darüber hinaus erklären wir die richtigen Methoden zur Bestimmung von Spannungen mit Einzelfarbsteuerungen und zur Abgrenzung positiver Tore mit Fluoreszenz minus 1 Steuerung. Die Hauptbeschränkung der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist das Fehlen von Gewebearchitektur. Diese Einschränkung kann durch Multiparameter-Flow-Zytometrie einzelner Augenkompartimente oder kostenlose Immunfluoreszenzfärbung überwunden werden. Die Immunfluoreszenz wird jedoch durch den Mangel an quantitativer Analyse und die geringere Anzahl von Fluorophoren auf den meisten Mikroskopen begrenzt. Wir beschreiben den Einsatz multiparametrischer Durchflusszytometrie zur hochquantitativen Analyse mononuklearer Phagozyten in laserinduzierter choroidaler Neovaskularisation. Darüber hinaus kann die Multiparameter-Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Makrophagen-Teilmengen, Schicksalskartierung und Zellsortierung für transkriptomische oder proteomische Studien verwendet werden.
Introduction
Das angeborene Immunsystem umfasst mehrere Zelltypen, die die Komplementaktivierung und Entzündung stimulieren. Angeborene Immunzellen umfassen natürliche Killerzellen (NK) Zellen, Mastzellen, Basophile, Eosinophile, Neutrophile, und mononukleäre Phagozyten. Mononukleare Phagozyten, die aus Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen bestehen, wurden in die Pathophysiologie mehrerer ophthalmologischer Erkrankungen wie Uveitis, diabetische Retinopathie und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)1verwickelt. In diesem Protokoll werden wir uns auf die Identifizierung mononuklearer Phagozyten mittels multiparameterr Flusszytometrieanalyse in einem Mausmodell der neovaskulären AMD2konzentrieren. Dieses Protokoll ist anpassungsfähig für Mausmodelle der diabetischen Retinopathie und/oder Uveitis, aber eine umfassendere Augensektion wird aufgrund der systemischen Natur dieser Krankheiten empfohlen.
Mononukleare Phagozyten exprimiert überlappende Zelloberflächenmarker. Langlebige Gewebe-Resident-Makrophagen und Mikroglia stammen aus dem aus dem Dottersack abgeleiteten Erythromyeloid-Vorläufer3, während das Recycling von Makrophagen und dendritischen Zellen sich vom Knochenmark-abgeleiteten makrophagenen dendritischen Zellvorläufer4unterscheidet. Zu den Mauszelloberflächenmarkern, die Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen gemeinsam sind, gehören CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17und der intrazelluläre Marker Iba18. Um diese Herausforderung zu meistern, definiert die transkriptomische Analyse von Makrophagen, Monozyten und dendritischen Zellen aus mehreren Geweben CD64 als makrophagenspezifischen Zelloberflächenmarker6. Makrophagen wurden in der Iris, Der Aderhaut, dem Ziliarkörper und dem Sehnerv in gesunden Augen beschrieben3. Alternativ ist die dendritische Zellidentifikation schwieriger; Die spezifischste Methode der dendritischen Zellidentifikation erfordert eine Schicksalskartierung mit der Zbtb46-GFP-Reportermaus9. Unabhängig von dieser Reporterzeile kann die Expression von CD11c und MHCII in Verbindung mit dem Fehlen von CD64 potenzielle dendritische Zellen6,10identifizieren. Dendritische Zellen wurden in Hornhaut, Bindehaut, Iris und Aderhaut in normalen Augen11identifiziert. Mikroglia sind spezialisierte Makrophagen in der Netzhaut, geschützt durch die Blut-Retina-Barriere, und abgeleitet von Dotter-Sac-Vorläuferzellen12. Dadurch kann die retinale Mikroglia von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen durch ihre düsteren Konzentrationen von CD45-Expression13 und hohen Konzentrationen von Tmem119 unterschieden werden, die als Durchflusszytometrie-Antikörper14erhältlich sind. Bei der Aktivierung von Mikroglia kann CD45 jedoch15 und Tmem119 herunterreguliert sein3, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, und dies ist wahrscheinlich sowohl für AMD als auch für sein Mausmodell relevant. Schließlich können Monozyten in mindestens zwei Subtypen unterteilt werden, darunter klassische und nicht-klassische. Klassische Monozyten zeigen CCR2+Ly6ChighCX3CR1Low Expression, und nicht-klassische Monozyten zeigen CCR2–Ly6ClowCX3CR1High Marker5.
Aufgrund der Notwendigkeit der quantitativen Analyse der Markerexpression, d.h. hoher im Vergleich zu niedrigen/niedrigen Konzentrationen, ist die Multiparameter-Flow-Zytometrie die ideale Methode zur Diskriminierung zwischen Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritischen Zellen im Auge und anderen Geweben. Weitere Vorteile sind die Identifizierung von Subpopulationen, die Möglichkeit, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur Sortierung von Zellpopulationen für transkriptomische oder proteomische Analysen zu verwenden, und Schicksalskartierung. Der Hauptnachteil der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist der Mangel an Gewebearchitektur. Dies kann durch die ophthalmologische Dissektion in die verschiedenen okulären Subkompartimente überwunden werden: Hornhaut, Bindehaut, Iris, Linse, Netzhaut und Aderhautsklera-Komplex. Darüber hinaus kann eine bestätigende Immunfluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden, ist jedoch durch die Anzahl der Marker und den Mangel an robuster Quantifizierung begrenzt.
Genomweite Assoziationsstudien haben mehrere Komplementgene mit AMD16verknüpft. Die Komplementaktivierung führt zur Anaphylatoxinproduktion, Zur Rekrutierung von Leukozyten und zu einer daraus resultierenden Entzündung. Bei Komplementrezeptor-Mangelmäusen reduziert die Laserverletzung die mononukleäre Phagozytenrekrutierung und den laserinduzierten choroidalen Neovaskularisationsbereich (CNV)17. In ähnlicher Weise zeigt die C-C-Motiv-Chemokin-Rezeptor-2 (CCR2)-Knockout-Maus, die einen Mangel an Monozytenrekrutierung im Gewebe hat, sowohl eine verringerte mononukleäre Phagozytenrekrutierung als auch den laserinduzierten CNV-Bereich18. Diese Daten verbinden Komplement und mononukleäre Phagozyten mit experimenteller CNV und möglicherweise neovaskulärer AMD. Zur Unterstützung dieser Assoziation werden Komplementrezeptoren bei Patienten mit neovaskulärer AMD19,20. Diese Daten zeigen einen starken Zusammenhang zwischen AMD und mononukleären Phagozyten.
In diesem Manuskript verwenden wir das experimentelle laserinduzierte CNV-Modell, um die mononukleären Phagozytenpopulationen im Mausauge mittels Multiparameter-Flow-Zytometrie zu charakterisieren. Laserinduzierte CNV ist das Standard-Mausmodell der neovaskulären AMD, das die Wirksamkeit der aktuellen ersten linie neovaskulären AMD-Therapie21demonstrierte. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation von Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine Einzelzellsuspension, die Antikörperfärbung, die Bestimmung von Laserspannungen mit Einzelfarbsteuerungen und die Gating-Strategie mit Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen. Eine detaillierte Beschreibung des laserinduzierten CNV-Modells finden Sie in einer früheren Publikation22. Mit diesem Protokoll definieren wir Mikroglia, Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagenpopulationen. Darüber hinaus werden wir MHCII und CD11c verwenden, um Makrophagen-Teilmengen innerhalb des laserinduzierten CNV-Modells weiter zu definieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die quantitative Analyse mehrerer Zelltypen in einem komplexen Gewebe. In diesem Bericht beschreiben wir die zytometrische Durchflussdetektion mononuklearer Phagozytenpopulationen, einschließlich Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen-Untergruppen, nach Laserverletzungen im Mausauge. Liyanage et al vor kurzem berichtet eine ähnliche Gating-Strategie, um Neutrophile zu erkennen, Eosinophile, Lymphozyten, DCs, Makrophagen, infiltrierende Makrophagen, und Monozy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAL wurde durch den NIH-Zuschuss K08EY030923 unterstützt; CMC wurde durch ein K01-Stipendium (5K01AR060169) des NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases und ein Novel Research Grant (637405) der Lupus Research Alliance unterstützt.
Materials
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
