עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה לעכל עיניים שלמות לתוך השעיית תא יחיד לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה רב-פרמטרית על מנת לזהות אוכלוסיות פיגוציטיות מונונוקולריות עיניות ספציפיות, כולל מונוציטים, מיקרוגליה, מקרופאגים ותאים דנדריטיים.
Abstract
מערכת החיסון המולדת ממלאת תפקידים חשובים בפתופיזיולוגיה עינית כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל. תאים חיסוניים מולדים, במיוחד פיגוציטים מונונוקולריים, מבטאים סמני פני תא חופפים, מה שהופך את זיהוי אוכלוסיות אלה לאתגר. ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח בו-זמני כמותי של סמני משטח תאים מרובים על מנת להבדיל בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעיני העכבר. פרוטוקול זה מתאר את ההסתעפות של עיני עכבר שלמות, ניתוח עיני, עיכול להשעיית תא יחיד וכתמים של השעיית התא הבודד עבור סמני תאים מיאלואידיים. בנוסף, אנו מסבירים את השיטות המתאימות לקביעת מתחים באמצעות פקדי צבע יחיד ולתיאור שערים חיוביים באמצעות פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד. המגבלה העיקרית של ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא היעדר ארכיטקטורת רקמות. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי cytometry זרימה מרובת פרמטרים של תאי עיניים בודדים או כתמי כשל חיסוני חינם. עם זאת, כשל חיסוני מוגבל על ידי חוסר ניתוח כמותי שלה מספר מופחת של פלואורופורים על רוב המיקרוסקופים. אנו מתארים את השימוש בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לספק ניתוח כמותי מאוד של פיגוציטים מונונוקולריים בניאווסקולריזציה כורואידית הנגרמת על ידי לייזר. בנוסף, ניתן להשתמש בציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים לזיהוי ערכות משנה של מקרופאגים, מיפוי גורל ומיון תאים עבור מחקרים תעתיקומיים או פרוטאומיים.
Introduction
מערכת החיסון המולדת כוללת סוגי תאים מרובים המעוררים הפעלה משלימה ודלקת. תאים חיסוניים מולדים כוללים תאי רוצח טבעי (NK), תאי פיטום, בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים, ופגוציטים מונונוקלריים. פיגוציטים מונונוקלריים, המורכבים ממונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים, היו מעורבים בפתופיזיולוגיה של תנאים אופטלמולוגיים מרובים כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)1. בפרוטוקול זה, נתמקד בזיהוי של phagocytes מונונוקולרי באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה רב פרמטרים במודל העכבר של AMD neovascular2. פרוטוקול זה ניתן להתאמה למודלים של עכברים של רטינופתיה סוכרתית ו/או uveitis, אך ניתוח עיניים נרחב יותר מומלץ בגלל האופי המערכתי של מחלות אלה.
פגוציטים מונונוקולריים מבטאים סמני פני תא חופפים. מקרופאגים ומיקרוגליה של תושבי רקמות לאורך זמן מקורם באקרומניאלואיד שק החלמון3, בעוד מיחזור מקרופאגים ותאים דנדריטיים מבדילים מאבן התא הדנדריטית4שמקורה במח העצם . סמני פני השטח של תאי העכבר המשותפים למונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים כוללים את CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17, ואת הסמן התאי Iba18. על מנת להתגבר על אתגר זה, ניתוח תמלולומי של מקרופאגים, מונוציטים ותאים דנדריטיים מרקמות מרובות מגדיר את CD64 כסמן משטח תא ספציפי למאקרופג ‘6. מקרופאגים תוארו הקשתית, choroid, גוף ciliary, ועצב הראייה בעיניים בריאות3. לחלופין, זיהוי תאים דנדריטי קשה יותר; השיטה הספציפית ביותר לזיהוי תאים דנדריטיים דורשת מיפוי גורל באמצעות עכבר הכתב Zbtb46-GFP9. ללא תלות בשורת כתב זו, ביטוי של CD11c ו- MHCII בשילוב עם היעדר CD64 יכול לזהות תאים דנדריטיים פוטנציאליים6,10. תאים דנדריטיים זוהו בקרנית, הלחמית, הקשתית והכורוידים בעיניים רגילות11. Microglia הם מקרופאגים מיוחדים הממוקמים ברשתית, מוגנים על ידי מחסום רשתית הדם, ומופקים מתאי שק חלמון12. כתוצאה מכך, microglia הרשתית ניתן להבדיל מקרופאגים נגזר מונוציט על ידי רמות עמומות שלהם של ביטוי CD4513 ורמות גבוהות של Tmem119, אשר זמין כמו נוגדן cytometry זרימה14. עם זאת, עם הפעלת microglia, CD45 יכול להיות מוסדר עד15 ו Tmem119 עשוי להיות מוסדר למטה3, המדגים את המורכבות של ביולוגיה microglia וזה רלוונטי ככל הנראה הן AMD והן מודל העכבר שלה. לבסוף, ניתן לחלק מונוציטים לשני תת-סוגים לפחות, כולל קלאסי ולא קלאסי. מונוציטים קלאסיים מציגים CCR2+Ly6CגבוהCX3CR1 ביטוינמוך, מונוציטים שאינם קלאסיים להדגים CCR2–Ly6CנמוךCX3CR1 סמניםגבוהים 5.
בשל הצורך בניתוח כמותי של ביטוי סמן, כלומר, רמות גבוהות לעומת רמות נמוכות/עמומות, ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא השיטה האידיאלית לאפליה בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעין וברקמות אחרות. יתרונות נוספים כוללים זיהוי אוכלוסיות משנה, היכולת להשתמש במיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי למיין אוכלוסיות תאים לצורך ניתוח תמלולומי או פרוטאומי ומיפוי גורל. החיסרון העיקרי של cytometry זרימה רב פרמטרים הוא חוסר ארכיטקטורת רקמות. זה יכול להיות להתגבר על ידי ניתוח עיניים לתוך subcompartments העין השונים: קרנית, הלחמית, איריס, עדשה, רשתית, קומפלקס choroid-sclera. בנוסף, הדמיית כשל חיסוני מאשר יכולה להתבצע, אך מוגבלת על ידי מספר הסמנים וחוסר כמות איתנה.
מחקרי עמותה רחבת גנום קישרו גנים משלימים מרובים עם AMD16. הפעלה משלימה מובילה לייצור אנפילטוקסין, גיוס לויקוציטים ודלקת כתוצאה מכך. בעכברים משלימים קולטן לקוי, פגיעה בלייזר מפחית גיוס phagocyte mononuclear ו neovascularization choroidal הנגרמת על ידי לייזר (CNV) אזור17. באופן דומה, קולטן כימוקין מוטיב C-C 2 (CCR2) עכבר נוקאאוט, אשר חסר בגיוס מונוציט לרקמה, מדגים הן ירידה בגיוס phagocyte מונונוקארי ואזור CNV המושרה בלייזר18. נתונים אלה קישור משלים phagocytes מונונוקולרי עם CNV ניסיוני ואולי AMD neovascular. לתמיכה של עמותה זו, קולטנים משלימים הם dysregulated על מונוציטים בדם היקפי בחולים עם AMD neovascular19,20. נתונים אלה מראים קשר חזק בין AMD לבין פיגוציטים מונונוקאריים.
בכתב יד זה, נשתמש במודל CNV המושרה בלייזר ניסיוני כדי לאפיין את אוכלוסיות הפגוציטים המונו-גרעיניות בעין העכבר באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים. לייזר המושרה CNV הוא מודל העכבר הסטנדרטי של AMD neovascular, אשר הוכיח את היעילות של טיפול AMD ניאו-וסקולרי השורה הראשונה הנוכחי21. פרוטוקול זה יתאר התכווצות של עיני עכבר, ניתוח עיני, עיכול לתוך מתלה תא יחיד, כתמי נוגדנים, קביעת מתחי לייזר באמצעות פקדי צבע יחיד, ואסטרטגיית gating באמצעות פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) פקדים. לקבלת תיאור מפורט של דגם CNV המושרה בלייזר, עיין בפרסום הקודם22. באמצעות פרוטוקול זה, אנו נגדיר אוכלוסיות מיקרוגליה, מונוציטים, תאים דנדריטיים ומאקרופאג’. יתר על כן, נשתמש ב- MHCII וב- CD11c כדי להגדיר עוד יותר ערכות משנה של מקרופאגים במודל CNV המושרה בלייזר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח כמותי של סוגי תאים מרובים ברקמה מורכבת. בדו”ח זה, אנו מתארים את הזיהוי הציטומטרי הזרימה של אוכלוסיות פיגוציטים מונונוקליות, כולל מונוציטים, תאים דנדריטיים ותת-קבוצות מקרופאגים, לאחר פגיעה בלייזר בעין העכבר. Liyanage et al דיווח לאחרונה על אסטרטגיית gat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAL נתמכה על ידי מענק NIH K08EY030923; CMC נתמך על ידי מענק K01 (5K01AR060169) מהמכון הלאומי NIH למחלות דלקת פרקים ושרירים ומענק מחקר חדשני (637405) מברית המחקר זאבת.
Materials
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
