توصيف الخلايا المناعية والوسطاء الالتهابيين في البيئة الرئوية
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد التغيرات في تكوين الخلايا المناعية ، وملف تعريف السيتوكين ، وملف تعريف الكيموكين في البيئة الرئوية بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر ، وهو نموذج فئران للسكتة الدماغية الإقفارية.
Abstract
قد يتغير توسع الخلايا المناعية وتنشيطها والاتجار بها إلى الرئتين ، والتي يتم التحكم فيها عن طريق التعبير عن السيتوكينات المتعددة والكيموكينات ، بسبب إصابة الدماغ الشديدة. ويتضح ذلك من حقيقة أن الالتهاب الرئوي هو سبب رئيسي للوفيات في المرضى الذين عانوا من السكتة الدماغية الإقفارية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف استخدام التحليل الخلوي للتدفق الخلوي متعدد الألوان لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية في رئتي الفئران ، بما في ذلك البلاعم السنخية ، والبلاعم الخلالية ، والخلايا المتغصنة CD103 + أو CD11b + (DCs) ، و DCs البلازما ، والحمضات ، والخلايا الوحيدة / الخلايا المشتقة من الخلايا الأحادية ، والعدلات ، والخلايا التائية والبائية المشتقة من اللمفاوية ، وخلايا NK ، وخلايا NKT ، بعد تحريض السكتة الدماغية الإقفارية عن طريق انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر. علاوة على ذلك ، نصف تحضير متجانسات الرئة باستخدام طريقة تجانس الخرز ، لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو كيموكينات في وقت واحد بواسطة صفائف خرز متعددة الإرسال إلى جانب التحليل الخلوي للتدفق. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة المناعية الرئوية في بيئات الأمراض الأخرى ، مثل أمراض الرئة المعدية أو أمراض الحساسية.
Introduction
الرئتين هي عضو حاجز ، يتعرض للبيئة الخارجية ، وبالتالي ، يتلقى باستمرار تحديات مناعية مثل مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية1. مطلوب تنشيط الخلايا المناعية المقيمة في الرئة وتسلل الخلايا المناعية من المحيط لإزالة مسببات الأمراض من البيئة الرئوية. بالإضافة إلى ذلك ، تحافظ الخلايا المناعية المقيمة في الرئة على التسامح مع البكتيريا المصاحبة ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تلعب دورا في إزالة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن1. البلاعم السنخية والخلالية هي من بين الخلايا المناعية الخافرة المقيمة في الرئة التي تستشعر مسببات الأمراض عبر مستقبلات التعرف على الأنماط وتزيل هذه مسببات الأمراض عن طريق البلعمة2. تربط الخلايا المتغصنة المقيمة في الرئة الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية من خلال عرض المستضد3. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج الخلايا المناعية الفطرية المحلية المنشطة السيتوكينات والكيموكينات التي تضخم الاستجابة الالتهابية وتحفز تسلل الخلايا المناعية مثل الخلايا الوحيدة والعدلات والخلايا الليمفاوية إلى الرئتين1. وقد ثبت أن السكتة الدماغية الإقفارية تعدل المناعة الجهازية وتؤدي إلى زيادة القابلية للإصابة بالعدوى الرئوية. ومع ذلك ، فقد قامت دراسات قليلة بتقييم المقصورة الرئوية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، على الرغم من أن بعض الدراسات فحصتها خلال الظروف الالتهابية4،5،6،7،8،9. الهدف من الطرق الموضحة هنا هو تحديد أمراض الرئة وتكوين الخلايا المناعية ومستويات تعبير السيتوكين والكيموكين في الرئتين في وقت واحد لتقييم التغييرات في المقصورة الرئوية وتقييم التغييرات المحتملة في الاستجابة المناعية الرئوية بعد نوبة نقص التروية.
الموصوف هنا هو بروتوكول للحصول على تعليق خلية واحدة من رئتي الفئران لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية. يعتمد هذا البروتوكول على هضم الأنسجة باستخدام الكولاجيناز D دون الحاجة إلى جهاز فصل الأنسجة الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول لإعداد متجانسات الأنسجة التي يمكن استخدامها لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو chemokines باستخدام صفائف الخرز متعددة الإرسال القائمة على قياس التدفق الخلوي. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للتحقيق في آثار السكتة الدماغية الإقفارية على المناعة الرئوية ويمكن استخدامه في نماذج الأمراض الأخرى أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح البروتوكولات الموصوفة هنا بتحديد أنواع الخلايا المناعية الرئوية والتعبير عن الكيموكينات أو السيتوكينات في نفس الماوس. إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء دراسة لأمراض الأنسجة ، فيمكن إزالة الفص الفردي وتثبيته لهذا الغرض قبل المتابعة إلى خطوات عزل الخلية الواحدة. أحد القيود على هذه الطريق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة P20 GM109098 وبرنامج جائزة الابتكار من Praespero إلى Edwin Wan. تم إجراء تجارب قياس التدفق الخلوي في منشأة WVU Flow Cytometry & Single Cell Core ، والتي تدعمها منح المعاهد الوطنية للصحة S10 OD016165 و U57 GM104942 و P30 GM103488 و P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
