Method Article

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

DOI:

10.3791/61359

⸱

June 24th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

Abstract

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면역 세포 확장, 활성화 및 여러 사이토카인 및 케모카인의 발현에 의해 조절되는 폐로의 밀매는 심각한 뇌 손상에 의해 변경될 수 있다. 이것은 폐렴이 허혈성 뇌졸중으로 고통받는 환자의 주요 사망 원인이라는 사실에 의해 입증됩니다. 이 프로토콜의 목표는 폐포 대식세포, 간질성 대식세포, CD103+ 또는 CD11b+ 수지상 세포(DCs), 혈장 세포질 DCs, 호산구, 단핵구/단핵구 유래 세포, 호중구, 림프구 유래 T 및 B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 마우스의 폐에서 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 다색 유세포 분석의 사용을 설명하는 것이며, 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색에 의한 허혈성 뇌졸중 유도에 이른다. 더욱이, 우리는 비드 균질화 방법을 사용하여 폐 균질액의 제조를 기술하고, 유세포 분석과 결합된 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 동시에 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정한다. 이 프로토콜은 또한 감염성 폐 질환 또는 알레르기성 질환과 같은 다른 질병 설정에서 폐 면역 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.

Introduction

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폐는 외부 환경에 노출되는 장벽 기관이므로 병원균 및 알레르겐1과 같은 면역 학적 도전을 끊임없이 받고 있습니다. 폐 거주 면역 세포의 활성화와 주변부에서 면역 세포의 침윤은 폐 환경에서 병원균을 제거해야합니다. 또한, 폐에 거주하는 면역 세포는 공생 박테리아에 대한 내성을 유지하며, 이는 이들 세포가 병원균 제거 및 항상성 유지에 중요한 역할을한다는 것을 암시합니다1. 폐포 및 간질성 대식세포는 패턴 인식 수용체를 통해 병원체를 감지하고 식균작용에 의해 이러한 병원체를 제거하는 폐 상주 감시자 면역 세포 중하나입니다 2. 폐-상주 수지상 세포는 항원 제시3을 통해 선천적 및 적응성 면역 반응을 연결한다. 또한, 활성화된 국소 선천적 면역 세포는 염증 반응을 증폭시키고 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 면역 세포의 폐로의 침윤을 자극하는 사이토카인 및 케모카인을 생성한다1. 허혈성 뇌졸중은 전신 면역을 변형시키고 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 허혈성 뇌졸중 후 폐 구획을 평가 한 연구는 거의 없지만 일부 연구는 염증 상태

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Protocol

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수행 된 모든 프로토콜과 절차는 웨스트 버지니아 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 마우스는 웨스트버지니아 대학교의 vivarium에서 특이적-병원체-비함유 조건 하에 수용되었다.

1. 용액의 제조

  1. 관류 완충액(인산완충식염수, PBS)을 준비한다. 마우스 당 약 두 개의 얼음처럼 차가운 PBS 분취량을 사용하십시오.
  2. 폐 세포 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오. FACS 완충액은 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 PBS를 함유한다. 폐 절제와 이동의 전체 과정을 위해 중간 정도를 차갑게 유지하십시오. 폐 샘플 당 약 8 mL를 준비하십시오. 실험 전에 신선한 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오.
  3. 단일 세포 분리를 위해 해리 완충액을 준비하십시오. 완충액은 행크의 완충 염 용액(HBSS)에 1mg/mL 콜라게나제 D와 200μg/mL DNase I을 함유한다. 실험 전에 원액 (100 mg / mL 콜라게나제 D 및 10 mg / mL DNase I)에서 신선하게 준비하십시오. 폐 샘플 당 약 6 mL가 필요합니다. 사용하기 전에 버퍼가 실온에 도달하는지 확인하십시오.
  4. 폐 조직 균....

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Results

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우리는 최근에 마우스에서 허혈성 뇌졸중 유도가 폐11의 면역 세포 조성을 변화시킨다고보고했다. 구체적으로, 일과성 뇌 허혈은 폐포 대식세포, 호중구 및 CD11b+ DC의 백분율을 증가시켰고, 폐 구획에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, NK 세포 및 호산구의 백분율을 감소시켰다. 또한, 세포 변화는 폐에서 여러 케모카인의 상당히 감소된 수준에 상응했다. 여기에 기재된 것은 폐 구획에서 상이한 면역 세포 집단의 단리 및 동정을 위한 방법이다. 여기에 나타난 대표적인 결과는 tMCAO 유도 및 가짜 수술을 받은 마우스로부터의 것이었다.

우리는 5-7 개의 항체를 포함하는 각 세트와 3 세트의 항체 조합을 사용하여 폐 (L1-L13)에서 13 개의 다른 면역 세포 집단을 확인했습니다 (그림 1). 죽은 세포는 각 세트에서 LIVE/DEAD 염색을 사용하여 배제하였다. 상.......

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Discussion

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여기에 기술된 프로토콜은 폐 면역 세포 유형의 확인 및 동일한 마우스에서 케모카인 또는 사이토카인의 발현을 허용한다. 조직병리학 연구가 바람직한 경우, 단일 세포 분리 단계로 진행하기 전에 개별 엽을 제거하고 그 목적을 위해 고정시킬 수 있다. 이 방법의 한 가지 한계는 면역 세포 조성의 변화와 케모카인 및/또는 사이토카인의 발현이 폐의 상이한 엽 사이에 불평등하게 분포될 것으로 예상되는 경우 일부 질병 설정에서 이 접근법이 적합하지 않을 수 있다는 것이다. 예를 들어, Mycobacterium tuberculosis 와 같은 일부 박테리아는 폐(21)의 특정 엽을 감염시키는 경향을 나타낸다. 이 경우 로브 간의 비교가 필요할 수 있습니다.

폐로부터의 단일 세포 분리 프로토콜의 농도, 배양 시간 및 온도는 폐로부터의 면역 세포의 회복에 중대한 영향을 미친다. 콜라게나제 D의 품질은 최적의 결과를 얻는 데 중요하며 콜라게나.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 NIH 보조금 P20 GM109098과 Praespero에서 Edwin Wan까지의 혁신 상 프로그램에 의해 지원되었습니다. 유세포 측정 실험은 NIH grants S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 및 P20 GM103434에 의해 지원되는 WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility에서 수행되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
B220-APC, 클론 RA3-6B2Biolegend1032121:200 희석
Beadbug 3 위치 비드 균질화기벤치마크 사이언티픽D1030조직 균질화기
CCR2-BV421, 클론 SA203G11Biolegend1506051:200 희석
CD103-BV421, 클론 2E7Biolegend1214221:200 희석
CD11b-PE/Cy7, 클론 M1/70Biolegend1012161:400 희석
CD11c-PE/Cy7, 클론 N418Biolegend1173181:200 희석
CD11c-Percp/Cy5.5, 클론 N418Biolegend1173281:200 희석
CD4-BV421, 클론 GK1.5Biolegend1004431:200 희석
CD45-FITC, 클론 30-F11Biolegend1031081:200 희석
CD64-APC, 클론 X54-5/7.1Biolegend1393061:200 희석
CD8-PE, 클론 53-6.7Biolegend1007081:800 희석
콜라겐분해효소 D시그마 알드리치11088882001해리 완충액의 구성 요소
원추형 스크류 캡 튜브ThermoFisher02-681-344조직 균질화용 튜브
DNase ISigma Aldrich10104159001해리 완충액의 구성 요소
Fc 블록 CD16/32 항체Biolegend1013201:100 희석
genlteMACS 해리기Miltenyi Biotec130-093-235기계적 해리기를 사용하거나 사용하지 않은 폐 소화의 비교
gentleMACS C 튜브Miltenyi Biotec130-093-237genlteMACS 해리기를 사용한 조직 디스코이에이션용 튜브
중단 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 CocktialThermoFisher78442균질화 완충액의 구성 요소
레이저 도플러 모니터MoorMOORVMS-LDFtMCAO
LEGENDplex 전염증성 케모카인 패널Biolegend740451Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stainThermoFisherL34976유세포 분석 중 사멸 세포 배제에 사용
Ly6C-PE, 클론 HK1.4Biolegend1280081:800 희석
Ly6G-BV510, 클론 1A8Biolegend1276331:200 희석
MCAO 봉합사 L56 재사용 가능 6-0 매체Doccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, 클론 M5/114.15.2Biolegend1076361:800 희석
NK1.1-Percp / Cy5.5, 클론 PK136Biolegend1087281 : 200 희석
Siglec F-PE, 클론 E50-2440BD Biosciences5521261 : 200 희석
실크 봉합사, 크기 6/0Fine Science Tools18020-60tMCAO
SomnoSuite 마취 시스템Kent ScientificSS-01tMCAO
TCRb-BV510 용 마우스 마취, 클론 H57-897Biolegend109234 1:200 희석
지르코니아/실리카 비드, 2.3mm균질화를 위한Biospec11079125z
조직 비드

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue ....

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