집중 스캐닝 초음파를 사용하여 뇌로 항체 전달
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 대소 또는 마우스 뇌 전체에 걸쳐 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 일시적으로 열어 형광 표지 항체를 전달하고 미세 아교세포를 활성화시키는 프로토콜입니다. 또한 조직학에 의한 항체 전달 및 미세아교세포 활성화를 검출하는 방법이 제시된다.
Abstract
뇌 질환을 표적으로 하는 치료 항체의 단지 작은 부분만이 뇌에 의해 흡수된다. 집중 초음파는 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 일시적인 개방을 통해 항체의 흡수와 참여를 증가시킬 수있는 가능성을 제공합니다. 우리 실험실에서는 여러 지점을 대상으로 두개골을 통한 집중 초음파 적용과 함께 마이크로 버블을 사용하여 다양한 형식의 항체가 BBB를 통해 전달되는 신경 퇴행성 질환에 대한 치료 접근법을 개발하고 있습니다.이 접근법은 주사 초음파 (SUS)라고 부릅니다. 혈관에 대한 마이크로버블과 초음파의 기계적 효과는 단단한 접합부를 일시적으로 분리함으로써 BBB를 가로지르는 부세포 수송을 증가시키고 소포-매개 트랜스사이토시스를 향상시켜 항체와 치료제가 효과적으로 교차할 수 있게 한다. 또한, 초음파는 또한 항체가 세포체 전체와 심지어 신경 과정으로 분포하는 뉴런과 같은 뇌 세포로 간질성 뇌에서 항체의 흡수를 용이하게합니다. 우리의 연구에서, 형광 표지 된 항체가 준비되고, 사내에서 준비된 지질 기반 마이크로 버블과 혼합되어 SUS가 뇌에 적용되기 직전에 마우스에 주입됩니다. 그런 다음 뇌에서 증가 된 항체 농도가 정량화됩니다. 정상적인 뇌 항상성의 변화를 설명하기 위해, 미세아교세포 식균작용은 세포 마커로 사용될 수 있다. 생성 된 데이터는 항체의 초음파 전달이 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 매력적인 접근법임을 시사합니다.
Introduction
치료 초음파는 부분적으로 뇌에 대한 치료제의 접근을 촉진함으로써 비침습적 인 방식으로 뇌 질환을 치료하기위한 새로운 기술입니다1,2,3. 뇌 질환을 표적으로 하는 치료 항체의 극히 일부만이 뇌에 흡수되어 뇌에 유지되기 때문에4, 치료 초음파는 그들의 흡수와 표적 참여를 증가시킬 수 있는 가능성을 제공한다5,6.
우리 실험실에서는 마이크로 버블을 사용하여 다양한 형식의 항체가 혈액 – 뇌 장벽 (BBB)을 가로 질러 전달되는 신경 퇴행성 질환에 대한 치료 접근법을 개발하고 있습니다. 이를 달성하기 위해 초음파는 두개골을 통해 여러 지점에서 뇌에 적용되며 스캔 모드를 사용하여 초음파 (SUS)7라고 부릅니다. 초음파 에너지, 정맥 주사 마이크로 버블 및 뇌 혈관 구조 사이의 기계적 상호 작용은 주어진 초음파 처리 볼륨에서 BBB의 단단한 접합부를 일시적으로 분리하여 항체 및 치료제를 포함한 다른 화물이이 장벽을 효과적으로 통과 할 수있게합니다7,8,9 . 더욱이, 초음파는 간질성 뇌에서 뉴런과 같은 뇌 세포로 항체의 흡수를 촉진하는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 항체는 세포체 전체와 심지어 신경질 과정으로 분포한다5,10.
알츠하이머 병은 아밀로이드 β 및 타우 병리학을 특징으로하며11 동물 모델의 호스트는 병원성 메커니즘을 해부하고 치료 전략을 검증 할 수 있습니다. 초음파가 뇌 전체에 순차적 인 패턴으로 적용되어 여러 치료 세션에 걸쳐 반복 될 때 SUS 접근법은 아밀로이드 β 침착 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 돌연변이 마우스의 뇌에서 아밀로이드 플라크 병리를 줄이고 아밀로이드를 흡수하는 미세 아교세포를 활성화하여인지 기능을 향상시킬 수 있습니다7. 초음파 및 마이크로버블을 이용한 BBB 개방은 또한 pR5, K3 및 rTg4510 타우 트랜스제닉 마우스5,12,13에서 타우 병리를 감소시킨다. 중요하게도, 미세아교세포는 세포외 단백질 침착물을 제거하는 반면, SUS에 의해 유도되는 신경내 병리에 대한 근본적인 클리어런스 메커니즘 중 하나는 뉴런 자가포식의 활성화이다12.
여기에서는 형광 표지 항체를 제조한 다음 사내 지질 기반 마이크로버블과 혼합한 다음 마취된 마우스에 역궤도 주사를 가하는 실험 과정을 간략하게 설명합니다. 역궤도 주사는 꼬리 정맥 주사의 대안이며, 우리는 똑같이 효과적이고 반복적으로 수행하는 것이 더 간단하다는 것을 발견했습니다. 이것은 즉시 SUS를 뇌에 적용하는 것으로 이어집니다. 치료 항체 흡수를 결정하기 위해, 마우스를 희생시키고 뇌에서 증가 된 항체 농도를 정량화합니다. 뇌 항상성 변화의 대리자로서, 미세아교세포 식세포 활성은 조직학 및 용적 3D 재구성에 의해 결정된다.
생성 된 데이터는 항체의 초음파 전달이 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 잠재적으로 매력적인 접근법임을 시사합니다. 상기 프로토콜은 다른 약물 후보물질뿐만 아니라 정의된 크기의 형광 표지된 덱스트란과 같은 모델 화물에도 유사하게 적용될 수 있다14.
Protocol
Representative Results
Discussion
형광 표지된 항체는 주사 모드에서 적용된 마이크로버블과 함께 집중된 초음파를 사용하여 뇌에 전달될 수 있다. 항체 전달, 미세아교세포 형태학 및 리소좀 확대는 초음파 주사 후 형광 현미경에 의해 검출될 수 있다. 미세아교세포는 Fc-수용체-매개 과정4에서 항체가 결합한 그들의 리소좀 항체 및 항원을 흡수할 수 있다.
이 방법을 사용하여 반복가능한 BBB…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Clem Jones AO 박사, 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 [GNT1145580, GNT1176326], 금속 재단 및 퀸즐랜드 주 정부 (DSITI, 과학, 정보 기술 및 혁신부)의 지원을 인정합니다.
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer’s double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer’s disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases – current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
