Entrega de anticorpos no cérebro usando ultrassom de varredura focalizado
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para abrir transitoriamente a barreira hematoencefálica (BBB) focalmente ou em todo o cérebro do rato para fornecer anticorpos fluorescentes e ativar microglia. Também é apresentado um método para detectar a entrega de anticorpos e ativação de microglia por histologia.
Abstract
Apenas uma pequena fração de anticorpos terapêuticos voltados para doenças cerebrais são tomados pelo cérebro. O ultrassom focado oferece a possibilidade de aumentar a absorção de anticorpos e o engajamento através da abertura transitória da barreira hematoencefálica (BBB). Em nosso laboratório, estamos desenvolvendo abordagens terapêuticas para doenças neurodegenerativas em que um anticorpo em diversos formatos é entregue em todo o BBB utilizando microbolhas, concomitante com aplicação de ultrassom focalizada através do crânio visando múltiplas manchas, uma abordagem que chamamos de ultrassom de varredura (SUS). Os efeitos mecânicos de microbolhas e ultrassom nos vasos sanguíneos aumentam o transporte paracelular através do BBB, separando transitoriamente junções apertadas e aumentando a transcitose mediada por vesículas, permitindo que anticorpos e agentes terapêuticos cruzem efetivamente. Além disso, o ultrassom também facilita a absorção de anticorpos do cérebro intersticicial em células cerebrais, como neurônios onde o anticorpo se distribui por todo o corpo celular e até mesmo em processos neuróticos. Em nossos estudos, anticorpos fluorescentes rotulados são preparados, misturados com microbolhas baseadas em lipídios preparados internamente e injetados em camundongos imediatamente antes de o SUS ser aplicado ao cérebro. O aumento da concentração de anticorpos no cérebro é então quantificado. Para explicar alterações na homeostase cerebral normal, a fagocitose microglial pode ser usada como marcador celular. Os dados gerados sugerem que o fornecimento de ultrassom de anticorpos é uma abordagem atraente para tratar doenças neurodegenerativas.
Introduction
O ultrassom terapêutico é uma tecnologia emergente voltada para o tratamento de doenças cerebrais de forma não invasiva, em parte facilitando o acesso de agentes terapêuticos ao cérebro1,2,3. Como apenas uma pequena fração de anticorpos terapêuticos voltados para doenças cerebrais são absorvidos e retidos no cérebro4, o ultrassom terapêutico oferece a possibilidade de aumentar sua absorção e engajamento direcionado5,6.
Em nosso laboratório, estamos desenvolvendo abordagens terapêuticas para doenças neurodegenerativas nas quais um anticorpo em vários formatos é entregue através da barreira hematoencefálica (BBB) usando microbolhas. Para isso, o ultrassom é aplicado através do crânio no cérebro em vários pontos usando um modo de varredura que chamamos de ultrassom de varredura (SUS)7. A interação mecânica entre a energia do ultrassom, os microbolhas injetadas por via intravenosa e a vasculatura cerebral separa transitoriamente as junções apertadas do BBB em um determinado volume de sônica, permitindo anticorpos e outras cargas, incluindo agentes terapêuticos para efetivamente atravessar essa barreira7,8,9 . Além disso, o ultrassom tem sido mostrado para facilitar a absorção de anticorpos do cérebro intersticicial em células cerebrais, como neurônios, onde o anticorpo se distribui por todo o corpo celular e até mesmo em processos neuróticos5,10.
A doença de Alzheimer é caracterizada por uma patologia amilóide-β e tau11, e uma série de modelos animais está disponível para dissecar mecanismos patogênicos e validar estratégias terapêuticas. Uma abordagem do SUS, pela qual o ultrassom é aplicado em um padrão sequencial em todo o cérebro, quando repetida em várias sessões de tratamento, pode reduzir a patologia da placa amiloide no cérebro de camundongos mutantes de proteína precursora amilóide-β (APP) e ativar microglia que toma o amiloide, levando à melhoria na função cognitiva7. A abertura do BBB com ultrassom e microbolhas também reduz a patologia tau em pR5, K3 e rTg4510 tau transgênicos camundongos5,12,13. É importante ressaltar que, enquanto a microglia remove depósitos de proteína extracelular, um dos mecanismos de liberação subjacentes às patologias intraneuronas induzidas pelo SUS é a ativação da autofagia neuronal12.
Aqui, delineamos um processo experimental, pelo qual anticorpos fluorescentes rotulados são preparados, e depois misturados com microbolhas à base de lipídios interna, seguidos de injeção retroorbital em camundongos anestesiados. A injeção retroorbital é uma alternativa à injeção da veia da cauda que descobrimos ser igualmente eficaz e simples de realizar repetidamente. Isso é imediatamente seguido pela aplicação do SUS no cérebro. Para determinar a absorção de anticorpos terapêuticos, os camundongos são sacrificados e o aumento da concentração de anticorpos no cérebro é então quantificado. Como proxy da mudança na homeostase cerebral, a atividade fagocítica microglial é determinada pela histologia e reconstrução volumosa 3D.
Os dados gerados sugerem que a entrega de ultrassom de anticorpos é uma abordagem potencialmente atraente para tratar doenças neurodegenerativas. O protocolo pode ser aplicado da mesma forma a outros candidatos a medicamentos, bem como a cargas modelo, como dextrans fluorescentemente rotulados de tamanhos definidos14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anticorpos fluorescentes podem ser entregues ao cérebro usando ultrassom focado juntamente com microbolhas aplicadas em um modo de varredura. O parto de anticorpos, a morfologia microglial e o alargamento liossômico podem ser detectados por microscopia de fluorescência após o ultrassom de varredura. Microglia pode entrar em seus anticorpos e antígenos lysossomes que os anticorpos têm vinculado em um processo mediado por receptores fc4.
Há uma série de etapas cr?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio do Dr. Clem Jones AO, do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália [GNT1145580, GNT1176326], da Fundação metal, e do Governo do Estado de Queensland (DSITI, Departamento de Ciência, Tecnologia da Informação e Inovação).
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
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