성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화
Summary
이것은 조직에 저산소 손상을 줄이기 위해 얼음 차가운 NMDG-aCSF와 함께 경내 관류 및 슬라이스 절단을 활용하는 성인 및 노화 마우스 해마의 급성 슬라이스 준비를위한 프로토콜입니다. 결과 슬라이스는 여러 시간 동안 건강하게 유지되며 장기 패치 클램프 및 필드 레코딩에 적합합니다.
Abstract
급성 해마 슬라이스는 신경 과학자의 세대를 활성화하여 시냅스, 뉴런 및 회로 특성을 자세히 탐구하고 충실도가 높습니다. LTP 및 LTD 메커니즘, 단일 신경 수지상 계산 및 회로의 경험에 의존하는 변화의 탐구는 이 고전적인 준비 없이는 불가능했을 것입니다. 그러나, 몇 가지 예외를 제외하고, 급성 해마 슬라이스를 사용하여 대부분의 기본적인 연구는 상대적으로 젊은 연령의 설치류에서 조각을 사용하여 수행되었습니다, ~ P20-P40, 시냅스 및 본질적 흥분 성 메커니즘은 P60 과거에 도달하는 긴 개발 꼬리를 가지고 있지만. 젊은 해마 슬라이스를 사용 하 여의 주요 매력은 저 산소 손상에 높은 내성에 의해 도움이 신경 건강의 보존. 그러나, 노화 뇌 준비를 필요로 하는 신경 퇴행성 질환의 다양한 동물 모델의 개발에 의해 더욱 강조되는 발달의 더 성숙한 단계에서 신경 기능을 이해할 필요가 있다. 여기서 우리는 안정적으로 성인과 노화 마우스 해마에서 건강한 조각을 제공하는 급성 해마 슬라이스 준비에 대한 수정을 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 간 근사 관류와 얼음 차가운 나트륨이 없는 NMDG-aSCF로 절단하는 것입니다. 함께, 이러한 단계는 참수 시 ATP에 저산소증 유발 하 강 하 뿐만 아니라 수동 나트륨 플럭스로 인한 세포 독성 부종을 감쇠. 우리는 진동 마이크로 토메를 사용하여 해마 플러스 피질의 트랜스 버들 조각을 잘라하는 방법을 보여줍니다. 이러한 방식으로 얻은 급성 해마 슬라이스는 여러 시간 동안 안정적으로 건강하며 형광으로 표시된 뉴런을 대상으로 하는 필드 레코딩 및 표적 패치 클램프 레코딩 모두에 적합합니다.
Introduction
포유류 급성 뇌 슬라이스 제제의 출현은 이전에 는 Aplysia1과같은 무척추 동물 제제에서만 가능했던 세포 및 시냅스 수준에서 실험을 촉진하였다. 급성 해마 슬라이스의 개발은 작업 기억과 문맥 형성을 담당하는 구조이기 때문에 특히 의미가 있었고, 생리학적 조작이 용이한 전문 삼중 시냅스 회로를 가지고 있다. 그러나, 급성 뇌 슬라이스의 대부분은 건강한 뉴런과 회로를 보존하는 것이 더 쉽기 때문에 상대적으로 젊은 마우스와 쥐로부터 여전히 준비되고, 슬라이스는 시간2,,3,,4의긴 기간 동안 실행 가능한 남아있다. 여기에서는 성인 및 노화 마우스에서 급성 해마 슬라이스의 생존 가능성이 증가하는 표준 슬라이스 프로토콜에 대한 수정을 소개합니다.
포유류 뇌 의 장기 전 생체 생존가능성에 대한 주요 장애물은 뇌로의 혈류가 중단되면 급속히 발생하는 초기 저산소 손상입니다. 산소의 손실은 인 크레아틴 (P-크레아틴)의 손실과 함께 뇌의 주요 에너지 자원의 빠른 신진 대사 소비의 결과 가장 빠른 되고, 포도당, 아데노신 삼호산염 (ATP), 및 글리코겐4다음. ATP의 보존은 NA-K ATPase를 통해 멤브레인 잠재력을 유지하기 위해 ATP가 필요하므로 뇌 슬라이스의 장기적인 건강에 특히 중요하며, 결과적으로 신경 활동5,,6. 성인 설치류 뇌의 ATP 수준은 ~2.5mM이며, 20초 이내에 급격히 떨어뜨려 약 1분 후 참수4,,7,,8에서기저 정상 상태(~0.5mMM)에 도달한다. 젊은 동물에서 ATP (~2분)에서 동일한 하락을 관찰하는 데 시간이 더 오래 걸립니다. 페노바르비탈 마취로 4분4로더 느려집니다. 이러한 고려 사항은 ATP 및 기타 에너지 자원의 손실을 방지하는 것은 뇌에 저산소 손상을 방지하고 차례로 오랜 기간 동안 뇌 슬라이스의 건강을 유지하기 위해 필요한 전략임을 보여줍니다, 특히 성인 동물.
낮은 온도는 신진 대사를 느리게. 따라서, 겸손한 저체온증이 뇌 에너지 매장량을 보호한다는 것이 입증되었습니다: 젊은 동물의 경우 체온을 6도 낮추고 37°C에서 31°C로, ATP 수준을 대조저 저산소증9의4시간 이상 정상 수준의 약 80%로 보존한다. P-크레아틴 수준은 유사하게 보존되고, 또한 전반적인 인산화전위도 9. 이것은 ATP의 거의 정상 수준이 슬라이스 절단 및 슬라이스 복구 기간을 통해 유지 될 수 있기 때문에 참수 전에 체온을 낮추는 것은 신경 보호일 수 있음을 시사합니다.
ATP 낙하가 참수 시 완전히 예방할 수 없는 정도까지, Na-K ATPase의 부분적으로 손상된 기능이 예상되며, 이어서 수동 나트륨 유입을 통한 탈극화가 뒤따릅니다. 수동 나트륨 유입은 세포로 물 입력에 선행되기 때문에, 그것은 세포 독성 부종과 결국 pyknosis를 일으키는 원인이 됩니다. 성인 쥐에서, 슬라이스 절단 솔루션에서 자당으로 Na + 이온을 교체하는 것은 세포 독성 부종의 부담을 완화하는 성공적인 전략이었다10,,11. 최근에는 나트륨 채널 투과성을 감소시키는 메틸화된 유기 양이온(12)은 특히 성인 마우스의 슬라이스에서 자당보다 더 효과적인 보호를 제공하는 것으로 나타났으며, N-메틸-D-글루카민(NMDG)은12 13,14,,15,,16에걸쳐 가장 광범위하게 적용되고 있다.,
수많은 뇌 슬라이스 프로토콜은 슬라이스 절단 단계에서만 차가운 온도를 사용하는 것을 포함하며 때로는 Na+ 이온 교체 전략16,,17과함께 합니다. 젊은 동물에서, 이러한 프로토콜은 두개골이 여전히 얇고 제거하기 쉽기 때문에 참수 후 신속하게 추출 할 수 있기 때문에 충분한 신경 보호를 제공하는 것으로 보인다3. 그러나,이 전략은 성인 동물에서 건강한 조각을 생산하지 않습니다. 시간이 지남에 따라, 성인 설치류를 연구하는 실험실의 숫자는 동물의 체온을 감소시키기 위해 얼음 차가운 솔루션과 경전 관혈을 도입했다, 따라서 뇌에 저산소 손상, 참수하기 전에. 이 절차는 소뇌 슬라이스18,중뇌 슬라이스19,신피성 슬라이스11,,20,과리라인 피질21,쥐 해마10,,22,,23,후각 전구24,복부 줄기 줄기25,시각 피질26을성공적으로 적용했다.
쥐와 쥐의 일부 뇌 영역에서 슬라이스를 준비하는 동안 경내 관류및 Na+ 이온 교체에 의해 제공되는 장점에도 불구하고, 마우스 해마는 저산소증으로부터 보호하기 위해 가장 어려운 영역 중 하나 남아13,,20. 현재까지, 신경 변성의 노화 마우스와 마우스 모델에서 해마를 슬라이스하는 가장 일반적인 접근 중 하나는 고립 된 해마(27)의고전적인 빠른 슬라이스를 포함한다. 여기에 설명된 프로토콜에서, 우리는 얼음 감기 Na+-무료 NMDG 기지를 둔 인공 뇌척수액 (NMDG-aCSF)로 동물을 경감하여 반갑게 침범하기 전에 저체온증을 도입하여 성인 뇌의 ATP의 손실을 최소화합니다. 슬라이스는 얼음 차가운 Na+-무료 NMDG-aCSF로 절단됩니다. 이 향상된 프로토콜로 우리는 슬라이스 후 최대 10 시간 동안 건강하고 장기 현장 기록 및 패치 클램프 연구에 적합한 성인 및 노화 마우스에서 급성 해마 조각을 얻습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 성인 및 노화 마우스에게서 얻은 해마 조각이 절단 후에 많은 시간 동안 건강하고 실행 가능한 남아 있다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 슬라이스는 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 CA1 영역에서 오래 지속되는 필드 레코딩에 적합합니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 단계는 얼음 차가운 용액을 가진…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
카를라 J. 샤츠 박사에게 조언과 지원을 해주신 것에 대해 감사드리며, 바바라 K. 브로트 박사와 미셸 K. 드루스 박사가 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 NIH EY02858과 MATHers 자선 재단이 CJS에 보조금을 지급함으로써 지원됩니다.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
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