Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen
Summary
Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.
Abstract
Akute Hippocampus-Scheiben haben es Generationen von Neurowissenschaftlern ermöglicht, synaptische, neuronale und Schaltkreiseigenschaften im Detail und mit hoher Genauigkeit zu erforschen. Die Erforschung von LTP- und LTD-Mechanismen, eine einzelne neurondendritische Berechnung und erfahrungsabhängige Veränderungen in den Schaltkreisen wären ohne diese klassische Zubereitung nicht möglich gewesen. Jedoch, mit wenigen Ausnahmen, die meisten Grundlagenforschung mit akuten Hippocampus Scheiben wurde mit Scheiben von Nagetieren relativ jungen Alters durchgeführt, P20-P40, obwohl synaptische und intrinsische Erregbarkeitsmechanismen haben einen langen Entwicklungsschwanz, der über P60 reicht. Der Hauptreiz der Verwendung von jungen Hippocampus-Scheiben ist die Erhaltung der neuronalen Gesundheit durch höhere Toleranz gegenüber hypoxischen Schäden unterstützt. Es ist jedoch notwendig, die neuronale Funktion in reiferen Entwicklungsstadien zu verstehen, was durch die Entwicklung verschiedener Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen, die eine alternde Gehirnpräparation erfordern, noch verstärkt wird. Hier beschreiben wir eine Modifikation zu einem akuten Hippocampus-Scheibenpräparat, das zuverlässig gesunde Scheiben von erwachsenen und alternden Maus-Hippocampi liefert. Die entscheidenden Schritte des Protokolls sind die transkardiale Perfusion und das Schneiden mit eiskaltem natriumfreiem NMDG-aSCF. Zusammen dämpfen diese Schritte den Hypoxie-induzierten Rückgang des ATP bei enthauptender Enthauptung sowie zytotoxische Ödeme, die durch passive Natriumflüsse verursacht werden. Wir zeigen, wie man transversale Scheiben von Hippocampus plus Kortex mit einem vibrierenden Mikrotom schneidet. Akute Hippocampus-Scheiben, die auf diese Weise erhalten werden, sind über viele Stunden der Aufnahme zuverlässig gesund und eignen sich sowohl für Feldaufnahmen als auch für gezielte Patch-Clamp-Aufnahmen, einschließlich der Ausrichtung auf fluoreszierend markierte Neuronen.
Introduction
Das Aufkommen von akuten Hirnscheibenpräparaten von Säugetieren erleichterte Experimente auf zellulärer und synaptischer Ebene, die bisher nur in wirbellosen Präparaten wie Aplysia1möglich waren. Die Entwicklung von akuten Hippocampus-Scheiben war von besonderer Bedeutung, da es sich um eine Struktur handelt, die für die Arbeitsgedächtnis- und Kontextbildung verantwortlich ist, und eine spezialisierte tri-synaptische Schaltung hat, die für eine einfache physiologische Manipulation zugänglich ist. Jedoch, die überwiegende Mehrheit der akuten Gehirnscheiben sind immer noch von relativ jungen Mäusen und Ratten vorbereitet, da es einfacher ist, gesunde Neuronen und Schaltkreise zu erhalten, und die Scheiben bleiben lebensfähig für längere Zeit2,3,4. Hier führen wir Änderungen an Standard-Slicing-Protokollen ein, die zu einer erhöhten Lebensfähigkeit von akuten Hippocampus-Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen führen.
Das Haupthindernis für die langfristige Ex-vivo-Lebensfähigkeit des Säugetierhirnparenchyms ist die anfängliche hypoxische Schädigung, die schnell auftritt, sobald der Blutfluss zum Gehirn nach der Enthauptung aufhört. Der Verlust von Sauerstoff führt zu einem schnellen metabolischen Verbrauch wichtiger Energieressourcen im Gehirn, wobei der Verlust von Phospho-Kreatin (P-Kreatin) am schnellsten ist, gefolgt von Glukose, Adenosintriphosphat (ATP) und Glykogen4. Die Erhaltung von ATP ist von besonderer Bedeutung für die langfristige Gesundheit von Hirnscheiben, da ATP benötigt wird, um das Membranpotenzial über die Na-K ATPase und damit die neuronale Aktivität5,6zu erhalten. Der ATP-Spiegel im erwachsenen Nagetierhirn beträgt 2,5 mM, und er fällt steil innerhalb von 20 s der Enthauptung ab, um einen basalen stationären Zustand (0,5 mM) bei etwa 1 min nach der Enthauptung4,7,8zu erreichen. Bei Jungtieren dauert es länger, den gleichen Rückgang der ATP zu beobachten (ca. 2 min); mit Phenobarbitalanästhesie wird es weiter auf 4 min4verlangsamt. Diese Überlegungen zeigen, dass die Verhinderung des Verlusts von ATP und anderen Energieressourcen eine notwendige Strategie ist, um hypoxische Schädigungen des Gehirns zu verhindern und im Gegenzug die Gesundheit von Gehirnscheiben über längere Zeiträume, insbesondere bei erwachsenen Tieren, aufrechtzuerhalten.
Niedrige Temperaturen verlangsamen den Stoffwechsel. Daher wurde nachgewiesen, dass eine bescheidene Unterkühlung die Energiereserven des Gehirns schützt: Bei Jungen Tieren, die die Körpertemperatur um sechs Grad von 37 °C auf 31 °C senken, bleibt der ATP-Gehalt auf etwa 80 % des normalen Niveaus über 4 h der kontrollierten Hypoxie9erhalten. Die P-Kreatin-Spiegel sind in ähnlicher Weise erhalten, ebenso wie das Gesamtphosphorylierungspotential9. Dies deutet darauf hin, dass die Senkung der Körpertemperatur vor der Enthauptung neuroprotektive sein könnte, da fast normale NIVEAUS von ATP durch die Schnitt- und Slice-Recovery-Perioden aufrechterhalten werden könnten.
In dem Maße, in dem ein ATP-Tropfen bei Enthauptung nicht vollständig verhindert werden kann, wird eine teilweise beeinträchtigte Funktion des Na-K ATPase erwartet, gefolgt von einer Depolarisation über passiven Natriumzufluss. Da auf den passiven Natriumzufluss wasserdurchströmt wird, verursacht er zytotoxische Ödeme und schließlich Pyknose. Bei erwachsenen Ratten war das Ersetzen von Na+-Ionen durch Saccharose in Slice-Cutting-Lösungen eine erfolgreiche Strategie, um die Belastung durch zytotoxische Ödeme zu lindern10,11. In jüngerer Zeit haben methylierte organische Kationen, die die Natriumkanaldurchlässigkeit12 verringern, gezeigt, dass sie einen wirksameren Schutz als Saccharose bieten, insbesondere in Scheiben von erwachsenen Mäusen, wobei N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) in verschiedenen Altersgruppen und Gehirnregionen am weitesten verbreitet ist13,14,15,16.
Zahlreiche Brain-Slicing-Protokolle beinhalten die Verwendung kalter Temperaturen nur während des Slice-Cutting-Schritts, manchmal in Kombination mit DerN+ Ionen-Ersatzstrategie16,17. Bei Jungen Tieren scheinen diese Protokolle ausreichend Neuroprotektion zu bieten, da die Gehirne nach der Enthauptung schnell extrahiert werden können, da der Schädel noch dünn und leicht zu entfernen ist3. Diese Strategie produziert jedoch keine gesunden Scheiben von erwachsenen Tieren. Im Laufe der Zeit haben eine Reihe von Laboratorien, die erwachsene Nagetiere untersuchen, eine transkardiale Perfusion mit einer eiskalten Lösung eingeführt, um die Körpertemperatur des Tieres und damit hypoxische Schädigungen des Gehirns vor der Enthauptung zu verringern. Dieses Verfahren wurde erfolgreich angewendet, um Kleinhirnscheiben18, Midbrain Scheiben19, neokortikale Scheiben11,20, perirhinal cortex21, rat hippocampus10,22,23, olfaktorische Glühbirne24, ventrales Striatum25, visuelle Kortex26.
Trotz der Vorteile, die die transkardiale Perfusion und der Na+ Ionenersatz bei der Vorbereitung von Scheiben von Ratten und in einigen Hirnregionen bei Mäusen bieten, bleibt der Hippocampus der Maus einer der schwierigsten Bereiche, um vor Hypoxie zu schützen13,20. Bis heute beinhaltet einer der häufigsten Ansätze, Hippocampus aus alternden Mäusen und Mausmodellen der Neurodegeneration zu schneiden, das klassische schnelle Schneiden des isolierten Hippocampi27. In dem hier beschriebenen Protokoll minimieren wir den Verlust von ATP im erwachsenen Gehirn, indem wir Hypothermie vor der Enthauptung einführen, indem wir das Tier transkardial mit eiskaltem Na+– freier künstlicher NMDG-basierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (NMDG-aCSF) durchdringen. Die Scheiben werden dann in eiskalten Na+-free NMDG-aCSF geschnitten. Mit diesem verbesserten Protokoll erhalten wir akute Hippocampus-Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen, die nach dem Schneiden bis zu 10 h gesund sind und für langzeitige Feldaufnahmen und Patch-Clamp-Studien geeignet sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zeigt, dass Hippocampus-Scheiben, die von erwachsenen und alternden Mäusen erhalten werden, nach dem Schneiden für viele Stunden gesund und lebensfähig bleiben können. Die mit diesem Protokoll vorbereiteten Slices eignen sich für Patch-Clamp-Aufnahmen sowie für langlebige Feldaufnahmen in den CA1-Regionen.
Dieses Protokoll besteht aus zwei wichtigen Schritten. Der erste Schritt ist der transkardiale Perfusionsschritt mit einer eiskalten Lösung. Schnelle B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich danke Dr. Carla J. Shatz für ihre Beratung und Unterstützung und Dr. Barbara K. Brott und Michelle K. Drews für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wird von NIH EY02858 und der Mathers Charitable Foundation an CJS unterstützt.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
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