Caracterização macro-reologia de Gill Raker Mucus na Carpa de Prata, Hipophthalmichthys molitrix
Summary
Este protocolo apresenta um método para realizar a caracterização da reologia do muco que reside em rakers de brânquias (GRs) da carpa prateada. Características viscoelásticas do GR-muco, obtidas pela medição da viscosidade, armazenamento e moduli de perda, são avaliadas pelo estresse de rendimento aparente para entender o mecanismo de alimentação do filtro em RGs.
Abstract
A carpa prateada, Hypophthalmichthys molitrix,é um peixe alimentador de filtros plâncido invasivo que infestava as vias navegáveis naturais da bacia do alto rio Mississippi devido ao seu mecanismo de alimentação de filtro altamente eficiente. Os órgãos característicos chamados gill rakers (GRs), encontrados em muitos desses alimentadores de filtros, facilitam a filtragem eficiente de partículas alimentares como fitoplâncton que são de alguns mícrons de tamanho.
A motivação para investigar a reologia do muco GR decorre do nosso desejo de entender seu papel em auxiliar o processo de alimentação do filtro na carpa prateada. O fluido rico em muco, em um estado “espesso e pegajoso”, pode facilitar a adesão de partículas alimentares. A permeação e o transporte através da membrana GR são facilitados pela ação de forças externas de tesoura que induzem taxas variadas de tensão de tesoura. Portanto, a reologia da muco pode fornecer uma pista vital para a tremenda natureza supercompetitante da carpa prateada dentro da piscina de peixes de alimentação de filtros. Com base nisso, foi postulado que o muco GR pode fornecer uma função adesiva às partículas alimentares e atuar como um veículo de transporte para auxiliar no processo de alimentação do filtro.
O principal objetivo do protocolo é determinar o estresse de rendimento do muco, atribuído ao estresse mínimo de cisalhamento necessário para iniciar o fluxo no qual a deformação plástica irreversível é observada pela primeira vez através de um material viscoelástico estruturado. Assim, as propriedades reológicas do muco GR, ou seja, viscosidade, armazenamento e moduli de perda, foram investigadas por sua natureza não newtoniana, de corte-afinamento usando um reômetro rotacional.
Um protocolo apresentado aqui é empregado para analisar as propriedades reológicas do muco extraído dos rakers de uma carpa prateada, pescada na localização de Hart Creek do rio Missouri. O protocolo visa desenvolver uma estratégia eficaz para testes reológicos e caracterização material do muco considerado um material viscoelástico estruturado.
Introduction
A carpa prateada, Hypophthalmichthys molitrix,é um alimentador de filtros plâncido e uma espécie invasora que se infiltrou em várias vias navegáveis naturais nos Estados Unidos. Esta espécie foi inicialmente introduzida na bacia do alto rio Mississippi para controlar as flores de algas1,2,3. A carpa prateada é um alimentador extremamente eficiente. Normalmente, seus tamanhos de partículas de alimentos consumíveis variam de 4 a 20 μm a zooplâncton maior que são em torno de 80 μm3,4,5. Esta espécie superou outros peixes nativos e pode potencialmente causar enormes danos às vias navegáveis nativas limitando os recursos disponíveis1,2,6. Assim, filtrar peixes que alimentam como a carpa prateada e a carpa cabeça grande representam uma grande ameaça para os Grandes Lagos1,2,6,7,8.
Os peixes de alimentação de filtros possuem órgãos especiais chamados de rakers de brânquias (GRs) com uma fina camada de muco residente em sua superfície. Esses órgãos melhoram a eficiência da filtração e agregação de pequenas partículas do fluido de entrada. O objetivo do protocolo aqui apresentado é caracterizar a propriedade material não newtoniana, de corte e produzir estresse do muco GR adquirido da superfície interna dos rakers de brânquia na carpa prateada. O valor do estresse de rendimento do GR-muco, verificado por meio de um reômetro rotacional, é de interesse neste estudo. O estresse de rendimento medido também chamado de “estresse de rendimento aparente” depende dos métodos de teste, como taxa de corte constante ou tensão oscilatória dinâmica tipo9,10. O “fluido de estresse de rendimento”, sofre uma transição do comportamento sólido para o líquido em um estresse aplicado crítico9,11. O estresse de rendimento aparente é o estresse mínimo de cisalhamento necessário para iniciar o fluxo ou aquele em que a deformação plástica irreversível é observada pela primeira vez quando o muco transita de um material semelhante a gel para um material semelhante a um fluido. Esse comportamento pode ser observado em materiais viscoelásticos estruturados. A transição do comportamento em gel para fluido do muco GR implica duas funções, ou seja, um papel adesivo para coletar partículas de alimentos e um papel de veículo de transporte para auxiliar no processo de entrega e filtragem de partículas. A função estendida do muco inclui a criação de barreiras de difusão na resistência e respiração da doença, fornecendo liberação controlada de fatores nutricionais, componentes tóxicos e excreção, criação de vias metabólicas para alimentação e aninhamento, auxiliando na proteção de predadores e produzindo modificações de camadas de fronteira que melhoram a locomoção e eficiência propulsiva12,13,14.
Ao contrário dos fluidos simples, fluidos complexos como o muco possuem propriedades que variam com as condições de fluxo e requerem parâmetros adicionais de medição para definir seu comportamento físico em escala a granel. Para monitorar a viscosidade e o estresse de rendimento do muco GR, as medições reológicas são realizadas utilizando um reômetro rotacional. O reômetro rotacional aplica um estresse ou tensão de tesoura estável ou oscilatória por meio de um disco rotativo em contato com a amostra de fluido e mede sua resposta. A lógica por trás do uso deste instrumento e técnica é que o reômetro pode fornecer um conjunto de medidas para descrever as propriedades materiais do muco GR da carpa prateada, que não pode ser definida apenas pela viscosidade.
O muco é um material viscoelástico e sua resposta mecânica a uma deformação imposta é entre a de um sólido puro (regido pela lei de elasticidade de Hooke) e o de um líquido puro (regido pela lei de viscosidade de Newton)15,16. A complexa rede macromolecular contida no muco pode esticar e reorientar em resposta a forças externas ou deformação. Um reômetro rotacional é composto por uma geometria de cone e uma placa Peltier, como mostrado na Figura 1 e Figura 2 (ver Tabela 1 para especificações de instrumentação). O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo para determinar as propriedades reológicas do muco gr. Uma vantagem do reômetro rotacional sobre um viscometro é sua capacidade de fazer medições dinâmicas usando pequenos volumes de amostra. O volume da amostra de muco GR neste estudo foi de aproximadamente 1,4 mL. O viscometro, por outro lado, limita-se a taxas constantes de tesoura e requer grandes volumes amostrais.
Espera-se que as propriedades reológicas do muco variem muito dentro da anatomia da carpa prateada. Por exemplo, as propriedades do muco residente nas superfícies gr podem ser diferentes do órgão epibranchial. Para explicar a potencial variabilidade das propriedades do muco em diferentes regiões do peixe, a amostra de muco GR adquirida foi diluída, e soluções de três concentrações foram criadas e testadas utilizando-se o reômetro rotacional.. Os dados e resultados relativos à reologia muco relatados após a execução do protocolo demonstraram a eficácia da técnica de medição. Os dados ilustrativos apresentados neste artigo não devem ser generalizados em toda a população de carpas de prata. O protocolo aqui apresentado pode ser estendido para investigar a reologia do muco em conjuntos de amostras maiores para testar outras hipóteses.
O objetivo deste estudo é demonstrar a variação das propriedades reológicas da reologia do muco GR com três concentrações diferentes de muco (400 mg/mL, 200 mg/mL e 100 mg/mL). A concentração de 400 mg/mL representa a amostra de muco cru colhida do peixe GRs. A água desionizada (DI) foi utilizada para diluir a amostra de muco cru em concentrações de 200 mg/mL e 100 mg/mL. Diluir as amostras de muco permitiu a avaliação do grau de afinamento da tesoura e do estresse de rendimento aparente em função da concentração e da determinação da concentração em que o muco gr transita para o comportamento não newtoniano. Um shaker foi usado para quebrar qualquer grande aglomerado de muco nas amostras para mitigar erros nos dados reológicos devido à inhomogeneidade.
Na maioria dos vertebrados, incluindo os peixes, as macromoléculas predominantes formadoras de muco são glicoproteínas (mucinas) que tendem a inchar na água por emaranhados ou cruzamentos químicos e criam um material semelhante a gel12,13,17,18,19,20. As macromoléculas de alto peso molecular, formadoras de gel e o alto teor de água refletem a escorregadia no muco13. Um alto grau de interações intermoleculares leva à formação de gel, enquanto níveis mais baixos de interações intermoleculares ou ligações quebradas resultam em fluidos de alta viscosidade21.
Os processos de filtragem de partículas alimentares em peixes de alimentação de filtros são auxiliados por propriedades relacionadas ao muco GR, como coesão e viscosidade que determinam seu potencial de adesão e aderência22. A força da adesão à base de muco depende de interações intermoleculares, eletrostáticas ou hidrofóbicas específicas23. Sanderson et al.24 realizaram um estudo de alimentação suspensa em peixes negros onde encontraram evidências de adesão à base de muco. Eles afirmaram que a adesão de partículas de alimentos suspensas com uma superfície mucosa é seguida pelo transporte de aglomerados agregados de partículas ligadas ao muco por fluxo de água direcionado agindo sobre ele24. O muco exposto às taxas de cisalhamento geradas a partir do fluxo de água facilita a entrega de partículas alimentares para órgãos digestivos. Técnicas endoscópicas foram utilizadas para observar partículas filtradas24.
A literatura sobre a gama de taxas de tesoura e limites práticos nos testes reológicos do muco gr é escassa. Assim, foram buscadas orientações de estudos reológicos sobre muco gástrico, nasal, cervical e pulmonar, muco da pele de salmão, lodo de peixe-bruxa e lubrificante da superfície da articulação óssea em que foram estudados os atributos reológicos e não newtonianos11,12,25,26,27,28,29,30,31. Mais recentemente, o efeito do muco da pele do peixe na locomoção e eficiência propulsiva tem sido estudado usando viscometria constante da taxa de corte. Estudos de reologia do muco da pele (sem qualquer diluição ou homogeneização) relativos ao seabream, sea bass e mísero demonstraram comportamento não newtoniano a taxas tipicamente baixas de tesoura14. Em outro estudo relacionado, as amostras de muco de pele crua dos lados dorsal e ventral da sola senegalesa apresentaram comportamento não newtoniano, indicando maior viscosidade do muco ventral em todas as taxas de corte consideradas32. Outros protocolos reológicos relativos ao desenvolvimento de andaimes de hidrogel e para suspensões altamente concentradas utilizando um viscometro de taxa de corte constante também foram relatados na literatura33,34.
Neste estudo, as propriedades de muco GR foram investigadas utilizando-se um reômetro controlado e rotacional controlado pela taxa de tensão que tem sido amplamente utilizado em experimentos de reologia em fluidos biológicos complexos25. Para os fluidos newtonianos, a viscosidade aparente permanece constante, é independente da taxa de corte e as tensões de tesoura variam linearmente com as taxas de tensão de tesoura(Figura 3A, B). Para fluidos não newtonianos (como fluidos de corte), a viscosidade é dependente da taxa de corte ou dependente da história de deformação(Figura 3A,B). O módulo de perda (G) representa até que ponto o material resiste à tendência ao fluxo e representa a viscosidade fluida(Figura 4). O módulo de armazenamento (G’) representa a tendência do material de recuperar sua forma original após a deformação induzida pelo estresse e equivale à elasticidade(Figura 4). O ângulo de fase (δ) ou o valor tangente de perda, é calculado a partir da tangente inversa de G”/G’. Representa o equilíbrio entre perda de energia e armazenamento e também é parâmetro comum para caracterização de materiais viscoelásticos (δ = 0° para um sólido hookean; δ = 90° para um líquido viscoso; δ 45° para um líquido viscoelástico) (Figura 4)25. O estresse de rendimento aparente (σy) em fluidos estruturados representa uma mudança de estado que pode ser observada em dados reológicos de varredura de estado constante e varreduras dinâmicas de tensão de estresse10. Se o estresse aplicado externo for menor do que o estresse aparente de rendimento, o material se deformará esteticamente. Quando o estresse excede o estresse aparente de rendimento (marcado como “estresse médio” na Figura 3B), o material passará do elástico para a deformação plástica e começará a fluir em seu estado líquido35. Medir o módulo de armazenamento (G’) e o módulo de perda (G”) na amostra de muco sob condições de estresse oscilatório (ou tensão) quantifica a mudança no estado material de comportamento líquido semelhante ao gel para o líquido viscoelástico.
Os tipos de testes de reômetro realizados para monitorar dados relativos ao módulo de armazenamento (G’), módulo de perda (G”) e viscosidade aparente (η) são descritos aqui. Os testes de oscilação dinâmica (varreduras de tensão e varreduras de frequência) monitoraram G’ e G” sob oscilação controlada da geometria do cone. Os testes dinâmicos de varredura de tensão determinaram a região viscoelástica linear (LVR) do muco monitorando a resposta intrínseca do material(Figura 4). As varreduras de tensão foram utilizadas para determinar o comportamento de rendimento na frequência e temperatura constantes de oscilação. Os testes dinâmicos de varredura de frequência monitoraram a resposta do material ao aumento da frequência (taxa de deformação) em uma amplitude constante (tensão ou estresse) e temperatura. A cepa foi mantida na região viscoelástica linear (LVR) para os testes dinâmicos de varredura de frequência. Os testes de taxa de corte de estado estável monitoraram a viscosidade aparente (η) sob rotação constante da geometria do cone. O muco gr foi submetido a etapas de estresse incremental e viscosidade aparente (η, Pa.s) foi monitorado para taxa de corte variada (ý, 1/s).
O protocolo apresentado neste artigo trata o muco GR como um material estruturado complexo de viscoelasticidade desconhecida com uma certa faixa de resposta viscoelástica linear. O muco de peixe foi extraído das RRs da carpa prateada durante uma expedição de pesca no riacho Hart no rio Missouri pela professora L. Patricia Hernandez (Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington) 1,2,36. Uma matriz de GRs dentro da boca de uma carpa prateada é mostrada na Figura 5A e um desenho esquemático é apresentado na Figura 5B. Um GR excised é mostrado na Figura 5C. A extração de muco de GRs da carpa prateada é apresentada como exemplo nos desenhos esquemáticos, Figura 5D, E. Todos os testes de reômetro foram realizados sob uma temperatura constante e controlada de 22 ± 0,002 °C, temperatura registrada no local de pesca1,2,36. Cada amostra de muco foi testada três vezes com o reômetro, e os resultados médios são apresentados juntamente com as barras de erro estatístico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dos principais objetivos do desenvolvimento deste protocolo é estabelecer que ele é adequado para a caracterização reológica do muco GR quando são disponíveis volumes amostrais muito pequenos. Reconhecemos que mais amostras de uma escola de carpas prateadas são necessárias para caracterizar totalmente as propriedades reológicas do muco GR e os dados aqui apresentados não são uma generalização em toda a população de carpas de prata. Nossa técnica se justifica por sua eficácia com caracterização reol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio e o financiamento do GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Agradecemos à professora L. Patricia Hernandez, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington, por inspirar a investigação e a colaboração em andamento, fornecendo conhecimento biológico sobre a fisiologia da carpa prateada e fornecendo amostras de muco. Agradecemos aos alunos, Sr. David Palumbo, Sra. Carly Cohen, Sr. Isaac Finberg, Sr. Dominick Petrosino, Sr. Alexis Renderos, Sra. Priscilla Varghese, Sr. Carter Tegen e Sr. Raghav Pajjur pela ajuda no laboratório e Sr. Thomas Evans e Sr. James Thomas da TA Instruments, New Castle, DE para apoio com treinamento e manutenção do reômetro. Imagens para figuras 5A,C foram tiradas durante uma dissecção realizada pela professora L. Patricia Hernandez, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington.
Materials
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | – | – | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
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