우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
MicroRNAs(miRNAs)는 mRNA의 번역 및 안정성을 감소시키는 메신저 RNA(mRNA)의 3'번역되지 않은 영역(UTR)에서 부분적으로 상호 보완적인 표적 부위에 결합하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 전형적으로 조절하는 단일 좌초, 비코딩 RNA 분자이다. 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 miRNA 발현 프로파일을 조사하였지만 마우스 신장에서 miRNA의 정제 및 정량화를 위한 표준 방법은 제공되지 않았다. 우리는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 신장 간질 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNA 발현을 추출하고 평가하기위한 효과적이고 신뢰할 수있는 방법을 설립했습니다. 프로토콜은 다섯 단계를 필요로: (1) 가짜와 일방적 인 요관 방해 (UUO) 마우스의 생성; (2) UUO 마우스로부터 신장 시료의 추출; (3) 신장 샘플에서 miRNA를 포함하는 총 RNA의 추출; (4) miRNA에서 역 전사를 가진 보완 DNA (cDNA) 합성; 및 (5) cDNA를 사용하여 qRT-PCR. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 대조군과 비교하여, miRNA-3070-3p의 발현이 현저하게 증가되었고 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현이 신장 간질 섬유증의 마우스 모델의 신장에서 현저히 감소되었다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스의 신장에 있는 miRNA 발현을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
서론
MicroRNAs (miRNA) - 메신저 RNA (mRNA)1의 분해 및 전사 억제를 일으키는 짧은 비코딩 RNA -는 생리학 과 질병 (예를 들어, 염증, 섬유증, 대사 장애 및 암)에서 중요한 역할을하는 다양한 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 일부 miRNAs는 따라서 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커 및2치료 대상이 될 수 있다2,3,,4,,5. 마우스 장기 및 뇌, 심장, 폐, 간 및 신장을 포함하는 조직에서 miRNA 발현 프로파일이6,7,,8,,9,,10을기재했지만 신장 간 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNAs의 추출 및 평가를 위한 표준 방법이 없었습니다.6
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프로토콜
모든 동물 실험 프로토콜은 지치의과대학의 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 지치의과대학 실험실 동물가이드의 실험동물 사용 및 관리 지침에 따라 시행되었다.
1. 가짜 수술
- 이소플루란, 코르크 시트, 탈취 크림, 실험실 물티슈, 인산염 완충식살린 살린 페트리 접시(PBS), 4-0 나일론, 핀셋, 수술 가위, 면봉, 8주된 C57BL/6 수컷 마우스 를 준비한다.
- 1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 그런 다음, 마우스의 복부에 디필 크림을 바르습니다. 몇 분 후, PBS에 흠뻑 젖은 실험실 닦아로 탈모 크림을 닦아.
- 마우스의 복부에 70% 에탄올을 주입한 다음 마우스를 마우스 시트에 놓습니다.
- 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.
- PBS로 두 면봉을 적신 다음 내장을 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 왼쪽 신장과 요관을 식별하기 위해 촉촉한 면봉을 놓습니다.
- 회막을 닫은 다음 4-0 나일론으로 절개를 닫습니다.
2. UUO 수술
- 이소플루란, 코르크 시트,....
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결과
UUO 마우스 모델은 20-25g의 8주 된 수컷 마우스에서21에 설명된 바와 같이 왼쪽 요관 결찰에 의해 만들어졌습니다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 진통제 (멜록시캠 5 mg/kg, 피하 주사) 수술 전과 수술 후 2 일 동안 매일 투여되었습니다. 수술 후 8일 동안 신장을 채취하고, PBS로 헹구고, 해부하고, 추가 분석을 위해 액체 질소에 저장하였다. 샴 작동 마우스는 대조군역할을 합니다. 왼쪽 신장에 수성 신증이있는 경우 이중 결찰이 성공합니다. 이러한 UUO 모델을 사용하여 얻은 miRNA qRT-PCR 데이터를 기반으로, miRNA-3070-3p의 수준이 크게 증가하여 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 수준이 대조군(도1)에비해 UUO 마우스의 신장에서 상당히 감소하였다.
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토론
qRT-PCR을 사용하는 전술한 프로토콜은 표적 miRNAs의 발현 수준을 성공적으로 결정했습니다. 추출된 miRNAs의 평가는 의미 있는 qRT-PCR 데이터를 얻기 위하여 길들이기 위하여, qRT-PCR를 수행하기 전에 miRNAs의 질을 확인하기 위하여, 280 nm에서 그280 nm에 흡수의 비율을 분광광계로 검사되어야 합니다. 예상 길이및 용융 온도 또는 모노모달 용융 곡선의 단일 PCR 증폭이 qRT-PCR에 의해 얻을 수 없는 경우, 반응 플레이트의 각 웰에 DNA 오염 또는 프라이머 이크머가 있을 수 있다.
miRNAs의 발현 수준은 마이크로어레이, 북부 블로팅 및 ribonuclease 보호 분석 방법을 포함하는 qRT-PCR 이외의 여러 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나 qRT-PCR은 정확하고 민감하며, 북부 블로팅 및 리보누벨리스 보호어마어마(22)에비해 qRT-PCR에 더 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있는 간단.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 원고의 초안을 편집한 에단츠 그룹(https://en-author-services.edanzgroup.com/)의 미셸 구디 박사에게 감사드립니다.
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재료
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| GA04SW | |||
| 1 | ER1004NA45-KF2,62 - 9968-32 |
참고문헌
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.....
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