일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가
Summary
우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.
Abstract
MicroRNAs(miRNAs)는 mRNA의 번역 및 안정성을 감소시키는 메신저 RNA(mRNA)의 3’번역되지 않은 영역(UTR)에서 부분적으로 상호 보완적인 표적 부위에 결합하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 전형적으로 조절하는 단일 좌초, 비코딩 RNA 분자이다. 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 miRNA 발현 프로파일을 조사하였지만 마우스 신장에서 miRNA의 정제 및 정량화를 위한 표준 방법은 제공되지 않았다. 우리는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 신장 간질 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNA 발현을 추출하고 평가하기위한 효과적이고 신뢰할 수있는 방법을 설립했습니다. 프로토콜은 다섯 단계를 필요로: (1) 가짜와 일방적 인 요관 방해 (UUO) 마우스의 생성; (2) UUO 마우스로부터 신장 시료의 추출; (3) 신장 샘플에서 miRNA를 포함하는 총 RNA의 추출; (4) miRNA에서 역 전사를 가진 보완 DNA (cDNA) 합성; 및 (5) cDNA를 사용하여 qRT-PCR. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 대조군과 비교하여, miRNA-3070-3p의 발현이 현저하게 증가되었고 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현이 신장 간질 섬유증의 마우스 모델의 신장에서 현저히 감소되었다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스의 신장에 있는 miRNA 발현을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
MicroRNAs (miRNA) – 메신저 RNA (mRNA)1의 분해 및 전사 억제를 일으키는 짧은 비코딩 RNA -는 생리학 과 질병 (예를 들어, 염증, 섬유증, 대사 장애 및 암)에서 중요한 역할을하는 다양한 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 일부 miRNAs는 따라서 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커 및2치료 대상이 될 수 있다2,3,,4,,5. 마우스 장기 및 뇌, 심장, 폐, 간 및 신장을 포함하는 조직에서 miRNA 발현 프로파일이6,7,,8,,9,,10을기재했지만 신장 간 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNAs의 추출 및 평가를 위한 표준 방법이 없었습니다.6
우리는 신장 간질 섬유증을 가진 마우스의 신장에 있는 miRNAs의 표정을 안정적으로 정화하고 검출하기 위하여 프로토콜을 디자인했습니다. 프로토콜에는 다음과 같이 다섯 가지 주요 단계가 포함됩니다. (1) 8주 된 C57BL/6 수컷 마우스는 신장 간질 섬유증에 연결되는 일방적인 요관 방해(UUO)를 제공하는 수술을 받는 가짜 작동(대조군) 및 마우스의 그룹으로 나뉩니다. (2) 신장 샘플은 샴 과 UUO 마우스로부터 추출되고, 실리콘 균질화로 별도로 균질화한 다음, 마이크로센심분리기 스핀컬럼(11,,12)에바이오 폴리머 분쇄 시스템으로 이송된다. (3) miRNA를 함유하는 총 RNA는 실리카 막 계 스핀컬럼(12,,13)에의해 신장 샘플로부터 추출된다. (4) 이 추출된 총 RNA를 이용하여, 상호 보완적인 DNA(cDNA)는 역전사, 폴리(A) 폴리머라제, 및 올리고-dT 프라이머14,,15를사용하여 총 RNA로부터 합성된다. (5) miRNAs의 발현은 상호염료(14,,15)를이용하여 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 평가된다.
본 프로토콜은 다양한조직(11,12,,13,,14,,15)에서miRNAs의 의미 있는 추출 및 평가를 획득한 조사에 기초하여, 프로토콜에 사용된 생체 중합체 분쇄 시스템은 2006년조직으로부터고품질, 총 RNA를 정제하는 것으로 나타났다., 또한, 선행 연구는 계열염,14,15를갖는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현의 판정을 위해 프로토콜(즉, 역실래, 폴리(A) 폴리머라제 및 올리고-dT 프라이머를 갖는 cDNA 합성의 양태의 정확성 및 민감도를 확인하였다. 새로운 프로토콜은 단순성, 시간 절약 및 기술적 오류의 감소의 장점을 가지고 있기 때문에, 프로토콜은 마우스 신장에서 miRNA 프로필의 정확하고 민감한 식별을 필요로하는 연구에서 사용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 많은 병리학 적 조건의 조사에 적용 될 수있다.
우리는 신장 간질 섬유증에 연결되는 UUO를 가진 마우스에 있는 miRNA 발현 단면도의 결정을 기술합니다. 인간에서, 신장 간질 섬유증은 그들의 병인학에 관계없이 만성 신장 질환과 말기 신장 질환 모두의 일반적이고 중요한 특징이다16,,17. 이러한 신장 간질 섬유증은 신부전의 진행과 관련이 있으며, 간질 공간에서 세포외 매트릭스 성분의 증가된 발현(예를 들어, 콜라겐, 섬유넥틴 및 α-부드러운 근육 액틴)을 특징으로 한다.17,18
Protocol
Representative Results
Discussion
qRT-PCR을 사용하는 전술한 프로토콜은 표적 miRNAs의 발현 수준을 성공적으로 결정했습니다. 추출된 miRNAs의 평가는 의미 있는 qRT-PCR 데이터를 얻기 위하여 길들이기 위하여, qRT-PCR를 수행하기 전에 miRNAs의 질을 확인하기 위하여, 280 nm에서 그280 nm에 흡수의 비율을 분광광계로 검사되어야 합니다. 예상 길이및 용융 온도 또는 모노모달 용융 곡선의 단일 PCR 증폭이 qRT-PCR에 의해 얻을 수 없는 경우, 반응…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고의 초안을 편집한 에단츠 그룹(https://en-author-services.edanzgroup.com/)의 미셸 구디 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
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