Overvåking av kreftcelleinvasjon og T-celle cytotoksisitet i 3D-kultur
Summary
Den presenterte tilnærmingen evaluerer samtidig kreftcelleinvasjon i 3D-sfæroidanalyser og T-cellecytoktoksisitet. Sfæroider genereres i et stillasfritt agarose multimikrobrønnstøpt. Co-kultur og innebygging i type I kollagen matrise utføres i samme enhet som gjør det mulig å overvåke kreft celle invasjon og T-celle mediert cytotoksisitet.
Abstract
Det er gjort betydelige fremskritt ved behandling av kreft med immunterapi, selv om et stort antall kreftformer fortsatt er resistente mot behandling. Et begrenset antall analyser gir mulighet for direkte overvåking og mekanistisk innsikt i samspillet mellom tumor- og immunceller, blant annet T-celler spiller en betydelig rolle i å utføre det cytotoksiske svaret til det adaptive immunsystemet til kreftceller. De fleste analysene er basert på todimensjonal (2D) co-kultur av celler på grunn av den relative brukervennlighet, men med begrenset representasjon av invasiv vekst fenotype, et av kjennetegnene på kreftceller. Nåværende tredimensjonale (3D) co-kultursystemer krever enten spesialutstyr eller separat overvåking for invasjon av co-kultiverte kreftceller og interagerende T-celler.
Her beskriver vi en tilnærming til samtidig å overvåke den invasive atferden i 3D av kreftcellesfæroider og T-celle cytotoksisitet i co-kultur. Sfæroiddannelse er drevet av forbedrede cellecelleinteraksjoner i stillasfrie agarose mikrobrønnkast med U-formede bunner. Både T-celle co-kultur og kreft celle invasjon i type I kollagen matrise utføres i mikrobrønner av agarose kaster uten behov for å overføre cellene, og dermed opprettholde en intakt 3D co-kultur system gjennom analysen. Kollagenmatrisen kan skilles fra agarose-støpt, noe som åpner for immunofluorescence (IF) farging og for konfokal avbildning av celler. Celler kan også isoleres for videre vekst eller utsettes for analyser som for genuttrykk eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Til slutt kan 3D-cokulturen analyseres av immunohistochemistry (IHC) etter innebygging og snitting. Mulige endringer av analysen inkluderer endrede sammensetninger av den ekstracellulære matrisen (ECM) samt inkludering av forskjellige stromale eller immunceller med kreftcellene.
Introduction
Til tross for betydelige forbedringer i kreftimmunterapi det siste tiåret, er vår mekanistiske forståelse av følsomhet og motstand mot behandlinger fortsatt ganske dårlig1. Det er veletablert at svulster viser betydelig heterogenitet, og at de dynamiske interaksjonene av tumorcellene med mikromiljøet, så vel som med immuncellene, påvirker tumorcelledød, invasiv oppførsel og respons på behandlinger som inkluderer immunterapi1,2,3. Som en arm av det adaptive immunsystemet utfører T-celler cellespesifikk cytotoksisitet. Analysen av T-cellegjenkjenning og respons på kreftceller gir mekanistisk innsikt i resistens og følsomhet for immunmodulerende behandlinger.
In vitro modellering og overvåking interaksjoner mellom kreft og T-celler i et passende miljø har vært utfordrende og så langt, resulterte i begrenset mekanistisk innsikt. De fleste cellebaserte analyser er avhengige av et todimensjonalt (2D)-miljø, som mangler viktige funksjoner som er avgjørende for å rekafulere den tredimensjonale (3D) in vivo fysiologi4,5,6 ,nemligromlige cellecelleinteraksjoner, kontakt med den ekstracellulære matrisen (ECM)7, dynamisk metabolsk etterspørsel, økt hypoksi på grunn avmassevekst 8, og effekter av tumormikromiljøet (TME)9. På den annen side er det fortsatt en rekke mangler med den nåværende brukte tredimensjonale (3D) co-kultur og invasjon analysesystemer: (1) den tidkrevende naturen av sfæroid generasjon oghøste 5,10, (2) mangel på kontroll over sfæroid størrelse, form og celletetthet 11,12, (3) lav gjennomstrømning type analyser, (4) kravet til spesialutstyr13,,14, (5) behovet for å overføre co-kultur til forskjellige miljøer for ulike analyser15,16,17. Spesielt fører overføring av en co-kultur analyse ofte til forstyrrelse av sfæroider og tap av samkulturintegriteten. Dette gjelder spesielt for “løse” sfæroider med redusert cellecelleadhesjon. For eksempel krever de fleste 3D-invasjonsanalyser at sfæroider høstes etter deres første formasjon og deretter brukes på igjen i ECM14,15,16. Dette resuspensjonstrinnet resulterer i tap av kontroll over avstanden mellom sfæroider. Siden avstanden mellom tumorsfæroider påvirker deres invasive oppførsel, introduserer dette tap av kontroll høy interanalysevarians og reduserer reproduserbarheten. Videre er anvendelsen av cellefraksjonsanalyser ved påfølgende sentrifugeringstrinn for vurdering av perifere og tumorsfæroide infiltrerende immunceller begrenset til tumorcellepopulasjoner som genererer mer stabile sfæroider17.
Konsept og tilnærming
Vår tilnærming tar for seg de ovennevnte manglene ved hjelp av en “Alt-i-ett”- 3D sfæroid co-kultur modell, som ikke krever overføring av sfæroider for påfølgende analyser. Vi tilpasset en spheroid formasjonsenhet (se Materialstabell ) for å generere en analyse for samtidig overvåking av invasiv oppførsel av kreftceller og cytotoksisitet av co-kultiverte T-celler. Denne metoden er brukervennlig, billig og gir rask og enkel håndtering i en relativt høy gjennomstrømming 3D-innstilling. Avhengig av hvilken type enhet som brukes, kan opptil 81 store sfæroider genereres i et enkelt pipetteringstrinn med kontroll over den individuelle sfæroidstørrelsen ved å endre antall celler som seedes. Sfæroiddannelse er tvunget av forbedrede cellecelleinteraksjoner i stillasfrie agarose multi-well casts med U-formede bunner. Vi tilpasset dette 3D-systemet for dynamiske cellebaserte funksjonelle studier samt endepunktmolekylære og biokjemiske analyser som inkluderer fluorescensaktivert cellesortering (FACS), immunofluorescens (IF) eller immunohistochemistry (IHC) farging samt genuttrykksanalyse av intakt 3D-co-kultur.
For funksjonellestudier, innebygging spheroider i type I kollagen i agarose kaster resulterer i invasjon av kreftceller fra like langt sfæroider og tillater overvåking av viktige celle linjespesifikke funksjoner, for eksempel enkeltcelle vs. kollektiv celle migrasjon18,,19. Videre er kollagenmatrisen lett atskilt fra agarose-støpt, noe som resulterer i en 1 \\ u20122 mm tykk patch som inneholder flere sfæroider, som kan videre behandles for IF-farging og avbildning ved konfokal mikroskopi. Dette kan avsløre distinkt celleinvasjon og cellematriseinteraksjoner i en screening med høy gjennomstrømming. Celler i kollagenmatrisen kan også isoleres etter kollagenfordøy og encelledissosiasjon for etterfølgende celledyrking eller analyse.
For IHC-analyse av sfæroider, etter fiksering og snitting av agarose cast, er proteiner eller andre molekyler av interesse påviselige samtidig som de geografiske posisjonene til sfæroidene opprettholdes. I tilnærmingen som er beskrevet her, er sfæroider direkte innebygd i Hydroxyetyl agarose behandlingsgel i agarose støpt og gelen fungerer som et “lokk” for å beholde sfæroider på bunnen av mikrobrønnene. Etter parafininnbygging av agarose støpt20,utføres seriell horisontal snitting med bunnen av støpt som utgangspunkt.
Denne tilnærmingen står i kontrast til konvensjonell IHC-snitting av sfæroider som krever høsting av celler før innebygging i Hydroxyethyl agarose behandling gel21 og risikerer forstyrrelse av sfæroider og dermed mister romlig arrangement av celler. Også cellefraksjon ved sentrifugering for å vurdere om immunceller infiltrert eller forble perifere til tumorsfæroider17 unngås ved direkte innebygging.
Videre kan 3D-co-kultur utføres ved å blanding av tumor, stromal eller immunceller, og dermed studere tumorcellekryssstalk eller rekapulere forskjellige tumormikromiljøer for å analysere cellecelleinteraksjoner, inkludert samkulturer med endotelceller16.
Denne 3D-sfæroide samkulturinnstillingen kan brukes til å utføre co-kultur av forskjellige celletyper som finnes i tumormikromiljøet og for å vurdere effekten av endrede ECM-elementer. Foruten type I kollagen, kan andre ECM-komponenter (f.eks matrigel, matrigel / kollagenblandinger, fibronectin), brukes siden tumorcelleinvasjon påvirkes av overflod av forskjellige underlag22. Også mikrobrønnene i agarose støpt er egnet for sfæroid dannelse av primære cellelinjer og for celler med lav cellecelle vedheft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som presenteres her beskriver 3D tumor sfæroid generasjon, som tillater co-kultur med T-celler, cellebaserte funksjonelle og molekylære analyser, samt en rekke overvåking og analyse muligheter ved hjelp av en enkelt enhet. Den største fordelen med vår tilnærming er at den ikke nødvendiggjør overføring av 3D-kulturen til en egen analyse og opprettholder integriteten til 3D-kulturen gjennom analysene.
Arbeidsflyten som presenteres her, kan endres etter behov. Inkubasjonstidene f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Virginie Ory, PhD for nyttige diskusjoner og råd om tilnærmingen til 3D-co-kulturmodellen. Vi takker også Elizabeth Jones for utmerket teknisk assistanse med IHC-seksjoneringen. Denne studien ble støttet av tilskudd fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) til YL (LI 2547/4-1) og National Institutes of Health til AW (R01 CA23 1291), til ATR (R01 CA205632), til GWP (R01 CA218670) og Core Grant of the Cancer Center (P30 CA51008).
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
- Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
- Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
- Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
- Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
- Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
- Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
- Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
- Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
- Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
- Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen’s RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, (2019).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
