Yetişkin Çayır Voles Nörojenik Nişler Türetilmiş Nörosferkültürü
Summary
Sosyal davranışlarla ilişkili fonksiyonel plastik değişikliklerin bir parçası olabilecek nörojenik nişler arasındaki cinsiyete bağımlı farklılıkları analiz etmek için, subventriküler bölgeden nöral progenitor hücrelerini kültüraltına alma ve çayır volelerinin yetişkin beyninin dentat giruslarını tamamlayıcı bir in vitro çalışma olarak belirledik.
Abstract
Nörosferler nöral kök hücreleri ve progenitor hücreleri oluşturan birincil hücre agregalarıdır. Bu 3D yapılar, nöral kök hücrelerin farklılaşma ve çoğalma potansiyelini belirlemek ve zaman içinde tahmin edilenegöre hücre hatları oluşturmak için mükemmel bir araçtır. Ayrıca, nörosferler bir niş oluşturabilirsiniz (in vitro) dinamik değişen ortamın modelleme sağlayan, bu tür değişen büyüme faktörleri gibi, hormonlar, nörotransmitterler, diğerleri arasında. Microtus ochrogaster (çayır sıçanı) sosyo-cinsel davranışlar ve sosyal biliş nörobiyolojik temelini anlamak için benzersiz bir modeldir. Ancak, bu davranışlarda yer alan hücresel mekanizmalar iyi bilinmemektedir. Protokol, nörosfer ler üretmek için, yapışık olmayan koşullar altında kültüre giren yetişkin çayır sıçanının nörojenik nişlerinden nöral progenitor hücreleri elde etmeyi amaçlıyor. Nörosferlerin büyüklüğü ve sayısı bölgeye (subventriküler bölge veya dentat girus) ve çayır sıçanının cinsiyetine bağlıdır. Bu yöntem, in vitro nörojenik nişlerde cinsiyete bağlı farklılıkları ve çift bağ ve çift ebeveyn bakımı gibi sosyal davranışlarla ilişkili nöroplastisite değişikliklerini incelemek için dikkate değer bir araçtır. Ayrıca, sosyal etkileşimlerde (otizm spektrum bozuklukları ve şizofreni) açıkları gerektiren bilişsel koşullar incelenebilir.
Introduction
Çayır sıçanı(Microtus ochrogaster),Cricetidae familyasından, sosyal olarak tek eşli ve son derece sosyal bir tür olarak gelişen küçük bir memeli türüdür. Hem erkek hem de dişiler çiftleşme veya yuva paylaşımı ile karakterize birlikte yaşama uzun süre sonra kalıcı bir çift bağ kurmak, kendi toprakları savunmak, ve kendi döl leri için biebeveyn bakım gösteren1,2,3,4. Böylece, çayır sıçanı sosyo-cinsel davranış ve sosyal biliş bozuklukları nın nörobiyolojik temelini anlamak için değerli bir modeldir5.
Erişkin nörogenez, davranış değişikliklerine yol açan nöral plastisitenin en önemli süreçlerinden biridir. Örneğin, araştırma grubumuz erkek volelerde hipokampusun subventriküler zonu (VZ) ve subgranular bölgede hücre çoğalmasının arttığını bildirmiş, bu da yetişkin nörogenezinin çayır voles (yayınlanmamış veriler) çiftleşme ile indüklenen çift bağ oluşumunda rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Öte yandan, yeni nöronların üretildiği ve entegre edildiği beyin bölgeleri iyi bilinmesine rağmen, bu süreçlerde yer alan moleküler ve hücresel mekanizmalar tüm beyin modeli6’dakiteknik sakıncalar nedeniyle belirsizliğini korumaktadır. Örneğin, gen ekspresyonu ve diğer hücresel faaliyetleri kontrol eden sinyal yolları nispeten kısa bir aktivasyon süresine sahiptir (fosfoproteom saptanması)7. Bir alternatif model izole ve yetişkin nörogenezi dahil moleküler bileşenleri açıklamak için yetişkin nöral kök hücreleri veya ata hücreleri kültürlü.
Yetişkin memeli in vitro nöral öncülleri korumak için ilk yaklaşım (fare) beyin nörosferlerin analizi oldu, hangi hücresel agregalar nöronlar oluşturmak için onların çok güçlü potansiyelini korumak non-yapışık koşullar altında büyüyen olan, yanı sıra astrositler8,9,10. Gelişimleri sırasında, sadece öncüllerin Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (FGF2) gibi mitojenlere yanıt verecekleri birseçim süreci vardır.
Bilgimiz dahilinde, literatürde bozkır farelerinden yetişkin nöral atalar elde etmek için bir protokol bildirilmemiştir. Burada, nöronal ataları nörojenik nişlerden ve bunların in vitro bakımlarından nörosfer formasyonu analizi ile izole etmek için kültür koşullarını oluşturduk. Böylece, deneyler nöral kök hücrelerin ve atalarının çoğalması, göçü, farklılaşması ve hayatta kalması, çayır faresinde hala bilinmeyen süreçler de dahil olmak üzere moleküler ve hücresel mekanizmaları belirlemek üzere tasarlanabilir. Ayrıca, VZ ve DG türetilen hücrelerin özellikleri in vitro farklılıkları açıklığa kavuşturan sosyo-cinsel davranış ve bilişsel davranışlardeğişiklikleri ile ilişkili nöral plastisite nörojenik nişler rolü hakkında bilgi sağlayabilir, ve sosyal etkileşimlerde açıkları (otizm spektrum bozukluğu ve şizofreni), aynı zamanda cinsiyete bağımlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir sinir kök hücre kültürü elde etmek için bir aşama enzimatik çözelti ile sindirim dönemi, hangi hücre canlılığını azaltabilir çünkü 30 dakikadan fazla olmamalıdır. Nörosferler ilk kültürden 8-10 gün sonra ortaya çıkmalıdır; 12. güne kadar ortaya çıkmazlarsa, kültürü atın ve deneyi tekrarlayın, sindirim süresini kısaltın. Başka bir sorun beyin dokusunu kaplayan kan damarları. Eritrositlerin aşırı nörosfer oluşumunu engelleyebilir, çünkü onlar tamamen diseksiyon sırası…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma CONACYT 252756 ve 253631 hibeler tarafından desteklenmiştir; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 ve IN203518; INPER 2018-1-163 ve NIH P51OD11132. Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris ve Susana Castro’ya mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
