التوصيف الكمي واللثي للأكياس الظهارية الظهارية الوظيفية والمستقطبة
Summary
تعد الأنظمة الخلوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) نماذج ذات صلة بالتحقيق في تكوين الأعضاء. ويقترح طريقة هيدروجيل القائم على إنتاج الخراجات الصفراوية وتوصيفها. هذا البروتوكول يكشف الحواجز من توصيف 3D، مع طريقة واضحة وموثوق بها لتقييم كفاءة تكوين الكيس، والأحجام، واختبار وظائفها.
Abstract
Cholangiocytes، الخلايا الظهارية التي تصطف القنوات الصفراوية في الكبد، والإشراف على تشكيل الصفراء وتعديلها. في السنوات العشرين الماضية، في سياق أمراض الكبد، ظهرت نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) تستند إلى cholangiocytes مثل الخراجات، الزفير، أو هياكل تشبه الأنابيب لتقليد طوبولوجيا الأنسجة لنشأة الأعضاء، والنمذجة المرض، ودراسات فحص المخدرات. وقد تم الحصول على هذه الهياكل أساسا عن طريق تضمين cholangiocytes في هيدروجيل. كان الغرض الرئيسي لدراسة التنظيم الذاتي من خلال معالجة القطبية الظهارية، والخصائص الوظيفية، والمورفولوجية. ومع ذلك، تركز دراسات قليلة جدا على كفاءة تكوين الكيس. وعندما يكون الأمر كذلك، غالباً ما يتم تحديد الكفاءة من صور طائرة واحدة. يتم إجراء التحاليل الوظيفية والتحليل الهيكلي دون تمثيل التغايرية المحتملة لتوزيع الكيسات الناشئة عن التغايرات التبليمرة الهيدروجيل والآثار الجانبية. ولذلك، لا يمكن استخدام التحليل الكمي، عند القيام به، للمقارنة من مادة إلى أخرى. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية لا تسمح بإجراء مقارنات لإمكانات النمو ثلاثية الأبعاد لمختلف المصفوفات وأنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، لا يوجد أي ذكر لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها التجريبية للخراجات المثبطة للمناعة. في هذه المقالة، ونحن نقدم طريقة موثوقة وعالمية لإظهار أن توزيع الخلايا الأولية يرتبط التوزيع الرأسي غير متجانسة من تكوين كيس. يتم اتباع خلايا تشولانجيوسيكي جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل مع Z-مداخن تحليل على طول عمق هيدروجيل على مدى الوقت من 10 أيام. مع هذه الطريقة، يتم الحصول على حركية قوية من كفاءة تكوين الكيس والنمو. ونحن نقدم أيضا طرق لتقييم قطبية الكيس وظيفة وإفرازية. وأخيراً، يتم توفير نصائح إضافية لتحسين بروتوكولات الكبت المناعي من أجل الحد من انهيار الكيس للتصوير. ويمكن تطبيق هذا النهج على دراسات أخرى لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد، مما يفتح إمكانيات مقارنة نظام بآخر.
Introduction
في العقود الثلاثة الماضية، تقدم مجال البحوث في المختبر نحو نظم الثقافة 3D. وقد ظهر عدد من البروتوكولات لخلايا زراعة في 3D كما spheroids أو المجاميع في وجود أو عدم وجود سقالة / مصفوفة، في قطرة، في التحريض، في الأجهزة microfluidic، أو العائمة1. وقد ثبت استخدام أساليب الثقافة 3D مزاياه على الثقافات 2-الأبعاد (2D)، لا سيما بالنسبة للخلايا الظهارية، والتي تبين أن التنظيم الذاتي في هياكل 3D، ودعا الخراجات أو acini. في هذه الحالة، تشكل الخلايا أحادية الطبقات تطويق التجويف، حيث الخلايا الحصول على النمط الظاهري الظهاري الكامل مع وظائف محددة الفسيولوجية المحسنة2.
وقد ساهمت العديد من الدراسات في تطوير أساليب لتشكيل هذه العضيات الظهارية في المصفوفات الطبيعية. وقد سمح هذا لtuapitulate في الخلية الخلية في الجسم الحي والخلايا الدقيقة البيئة التفاعلات، للحصول على إنشاء واستقرار الظاهري الظهارية3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة ، وعلى وجه الخصوص بهدف تطوير organoids القابلة للزراعة وفك متطلبات البيئة الدقيقة لتنظيم البرنامج الظهاري ، وقد وضعت الهيدروجيل الاصطناعية لتعزيز تشكيل aciniظهاري 8،9،10. للأسف ، هذه الدراسات تقرير عن البيانات النوعية ، أو أساليب حساب الحالية باستخدام المراجع الداخلية مثل نسبة الخراجات على غير الخراجات في طائرة 2D8،9،10. وهذا يمنع أي مقارنة بين الدراسات المختلفة من حيث الكفاءة والاستقرار، أو التوصيف المورفولوجي والفسيولوجي للعضويات الظهارية.
وقد سمح صغر حجم الخلايا الظهارية في الخرز باستخدام الأجهزة microfluidic للحصول على نتائج أكثر واقعية الكمية والمقارنة. باستخدام هذه التكنولوجيا ، تم تشكيل organoids من أنواع الخلايا المختلفة وتفاضلها على أساس مورفولوجيا بين مختلف الهياكل الخلوية 3D11،12. ومع ذلك ، فإن هذه التكنولوجيا ليست سهلة للعمل مع وتتطلب استخدام غرف نظيفة لإنتاج الأجهزة microfluidic. وقد أنشئت هذه التكنولوجيا لبعض أنواع من الهيدروجيل ولكنها تتطلب التكيف التقني لتطبيقها على الهيدروجيل الأخرى، مما يحد من تعدد استعمالاتها. لذلك، تعتمد معظم الدراسات التي تهدف إلى تطوير العضيات الظهارية على تضمين الخلايا الظهارية في الجزء الأكبر من الهيدروجيل. في هذه الطرق ، وغالبا ما يتم إهمال التغايرية العالية للجيل structuration وتوزيع الخلايا داخل الثقافة 3D كله. ولذلك، فإن معظم التحليلات تتعلق بصور 2D واحدة، والتي تمثل فقط تقريباً توزيع الكائنات الخلوية المختلفة في وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد.
الأمراض التي تؤثر على القنوات الصفراوية، مثل cholangiocarcinoma، التنافر الصفراوي، التهاب القولون الشوكولي الأولي، من بين أمور أخرى، هي سبب رئيسي للوفيات والمراضة. باستثناء زراعة الكبد، لا توجد علاجات فعالة لهذه الحالات13. الجهود المبذولة للتحقيق في تكوين القناة الصفراوية، وأسباب المرض، والتقدم سوف تسمح لتطوير العلاجات الجديدة14.
وقد وضعت نماذج الهياكل المرارة من الخراجات، spheroids أو هياكل تشبه أنبوب باستخدام العادي أو المريض المستمدة، متمايزة، أو سلف المشتقة من خطوط الخلايا cholangiocyte15،16،17،18،19،20. وقد لخصت دراسات مختلفة قطبية cholangiocyte, التعبير عن علامات cholangiocyte, وجود أهداب, إفراز cholangiocyte والقدرة الاستيعابية, وتشكيل تجويف وعرقلة; كل منها يمثل خصائص هامة من النمط الظاهري cholangiocyte ، مورفولوجيا ، والوظيفة15،17،19. وأفادت آخرون الحفاظ على organoids الصاري المستمدة من المريض لفترات طويلة من الوقت20. في الآونة الأخيرة، قمنا بالتحقيق في دور الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية على الخراجات الصفراوية21. الأهم من ذلك، تمت دراسة التسبب في الرضّاء من الزّرّية الصفراوية في الزّوئيّات الصفراوية و الأنابيب7،22. وعلاوة على ذلك، تمت دراسة السمات الرئيسية لالتهاب الشفة الزخراب الصلاسية الأولية مثل شيخوخة cholangiocyte، إفراز السيتوكينات الموالية للالتهابات، فضلا عن تجنيد الضامة بنجاح باستخدام spheroids الصفراوية15،20. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى نماذج كمية 3D في المختبر التي تعدل من الناحية الفسيولوجية النمط الظاهري للكولينجيويت ، وعلم وظائف الأعضاء ، والبياضة الدقيقة حيث يمكن معالجة هذه الأسئلة. وعلاوة على ذلك، ذكرت المنشورات قليلة فقط تكوين الكيس كفاءة21،23. هذه نقطة مهمة لإنشاء, لا سيما عند التحقيق في تكوين الأعضاء, سبب المرض, وارتباط الاستجابات المخدرات مع وظيفة cholangiocyte والاستقطاب. وبالإضافة إلى ذلك، مع وجود اختلافات في سقالة / مصفوفة المستخدمة من بروتوكول إلى بروتوكول، فإنه من الصعب مقارنة بين النظم. لحل هذه القضايا، نقترح طريقة كمية وموثوقة وعالمية لتوليد الخراجات الصفراوية تحاكي تشكيل التجويف، والاستقطاب cholangiocyte، ووظيفة إفرازات cholangiocyte. الأهم من ذلك، ونحن نقدم تحليلا منهجيا على طول المحور Z عبر هلام 3D عند تقييم مع مرور الوقت، كفاءة تكوين الكيس، وحجم، ومقومات البقاء، والاستقطاب، والوظائف. وعلاوة على ذلك، استخدمنا هيدروجيل طبيعي والجرذان cholangiocytes الطبيعية (NRC) ق، كمثال للبروتوكول، ولكن غيرها من الهيدروجيلات الطبيعية أو الاصطناعية، فضلا عن الخلايا الظهارية يمكن استخدامها لتشكيل هياكل الكيسي 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل دراسة تكوين الأعضاء وصيانة الهياكل الخلوية 3D، وقد تم نمذجة الأنسجة المختلفة، وذلك باستخدام أصول الخلوية المختلفة ولكن أيضا أنواع مختلفة من المصفوفات خارج الخلوية بما في ذلك الهيدروجيل الاصطناعية8،9،10،21. ومع ذل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور نيكولاس لاروسو (مايو كلينك، روتشستر، مينيسوتا، الولايات المتحدة)، الذي تكرم بتوفير خط الخلايا في المركز النرويجي للاجئين.
وقد تلقى هذا العمل الدعم المالي من برنامج iLite RHU (منحة ANR-16-RHUS-0005) وHHU Hepatinov.
نشكر إيزابيل غارسين وRéseau d’Imagerie Cellulaire باريس Saclay لدعمهم في التصوير.
Materials
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA – flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , (2010).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
- Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
- Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
- Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
- Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
- Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
- Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D’hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
- Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies – Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
- Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
- De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
- Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
- Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
- Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
- Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
- Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
- Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. , (2019).
- Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
- Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
- Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O’Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
- Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).
