ייצור ואפיון כמותי של ציסטות אפיתל מרה פונקציונליות ומקוטבות
Summary
מערכות תאיות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) הן מודלים רלוונטיים לחקירת אורגנוגנזה. שיטה מבוססת הידרוג’ל לייצור ציסטות מרה ואפיון שלהם מוצע. פרוטוקול זה חושף את המחסומים של אפיון תלת-מימד, עם שיטה פשוטה ואמינה להערכת יעילות היווצרות ציסטה, גדלים, ולבדוק את הפונקציונליות שלהם.
Abstract
Cholangiocytes, תאי האפיתל כי בשורה את תעלות המרה בכבד, לפקח על היווצרות מרה ושינוי. בעשרים השנים האחרונות, בהקשר של מחלות כבד, מודלים תלת מימדיים (3D) המבוססים על cholangiocytes הופיעו כגון ציסטות, spheroids, או מבנים דמויי צינור לחקות טופולוגיה רקמות עבור organogenesis, מידול מחלות, מחקרי סינון סמים. מבנים אלה הושגו בעיקר על ידי הטבעת cholangiocytes בהידרוג’ל. המטרה העיקרית הייתה ללמוד ארגון עצמי על ידי טיפול בקוטביות אפיתל, פונקציונלי, ומאפיינים מורפולוגיים. עם זאת, מעט מאוד מחקרים מתמקדים ביעילות היווצרות ציסטה. כאשר זהו המקרה, היעילות מכמתת לעתים קרובות מתמונות של מטוס יחיד. בדיקות פונקציונליות וניתוח מבני מבוצעים מבלי לייצג את ההטרוגניות הפוטנציאלית של התפלגות ציסטה הנובעת הטרוגניזציה של פולימר הידרוג’ל ותופעות לוואי. לכן, אין אפשרות להשתמש בניתוח הכמותי, כאשר הוא נעשה, להשוואה ממאמר אחד לאחר. יתר על כן, מתודולוגיה זו אינה מאפשרת השוואות של פוטנציאל צמיחה תלת-מית-מיו של מטריצות וסוגי תאים שונים. בנוסף, אין אזכור של פתרון בעיות ניסיוני עבור ציסטות immunostaining. במאמר זה, אנו מספקים שיטה אמינה ואוניברסלית כדי להראות כי התפלגות התא הראשונית קשורה התפלגות אנכית הטרוגנית של היווצרות ציסטה. תאים Cholangiocyte מוטבע הידרוג’ל מלווה בניתוח Z-stacks לאורך עומק הידרוג’ל לאורך הזמן של 10 ימים. בשיטה זו, קינטיקה חזקה של יעילות היווצרות ציסטה וצמיחה מתקבלת. אנו גם מציגים שיטות להערכת קוטביות ציסטה ותפקוד הפרשה. לבסוף, טיפים נוספים למיטוב פרוטוקולי אימונוסטיין מסופקים כדי להגביל את קריסת ציסטה להדמיה. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים של תרבות תאים תלת-מיוד, ובכך לפתוח את האפשרויות להשוות מערכת אחת לאחרת.
Introduction
בשלושת העשורים האחרונים, תחום המחקר במבחנה התקדם לעבר מערכות תרבות תלת-מית-מיו. מספר פרוטוקולים צצו עבור תאים culturing ב3D כמו spheroids או אגרגטים בנוכחות או היעדר פיגומים / מטריצה, בטיפה, בעצבנות, בהתקנים מיקרופלואידים, אוצף 1. השימוש בשיטות תרבות תלת-ממדיות הוכיח את יתרונותיו על פני תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), במיוחד עבור תאי אפיתל, אשר הוכחו כארגון עצמי במבנים תלת-ממדיים, הנקראים ציסטות או אצ’יני. במקרה זה, התאים יוצרים שכבת מונו-שכבתית המקיפה לומן, שבו תאים לרכוש פנוטיפ אפיתל המלא שלהם עם פונקציות פיזיולוגיות ספציפיות משופרות2.
מחקרים רבים תרמו לפיתוח שיטות לגבש אורגנואידים אפיתל אלה במטריות טבעיות. זה אפשר לסיכום באינטראקציות vivo תא תא ומיקרו-סביבה, כדי לקבל את הממסד ואת היציבות של פנוטיפ אפיתל3,4,5,6,7. לאחרונה, ובמיוחד במטרה לפתח אורגנואידים להשתלה ולפענח את הדרישה של microenvironment לתיאום תוכנית האפיתל, הידרוג’לים סינתטיים פותחו כדי לשפר את היווצרות של אפיתל acini8,9,10. למרבה הצער, מחקרים אלה מדווחים על נתונים איכותיים, או מציגים שיטות חישוב באמצעות הפניות פנימיות כגון היחס בין ציסטות על-פני ציסטות במטוס דו-מימד8,9,10. זה מונע כל השוואה בין מחקרים שונים במונחים של יעילות, יציבות, או אפיון מורפולוגי ופיזיולוגי של אורגנואידים אפיתל.
מיקרו-אנקסטלציה של תאי אפיתל בחרוזים באמצעות מכשירים מיקרו-נוזלים אפשרה תוצאות כמותיות והשוואתיות מציאותיות יותר. באמצעות טכנולוגיה זו, אורגנואידים מסוגי תאים שונים נוצרו והבדילו בהתבסס על מורפולוגיה בין מבנים תאיים תלת-מימדשונים 11,12. עם זאת, טכנולוגיה זו אינה קלה לעבודה ודורשת שימוש בחדרים נקיים כדי לייצר את המכשירים המיקרו-נוזלים. טכנולוגיה זו הוקמה עבור מספר סוגים של הידרוג’לים אך דורשת התאמה טכנית כדי להיות מיושמת על הידרוג’לים אחרים, הגבלת הרב-תכליתיות שלה. לכן, רוב המחקרים שנועדו לפתח אורגנואידים אפיתל להסתמך על הטבעה של תאים אפיתל בצובר הידרוג’ל. בשיטות אלה, הטרוגניות גבוהה של ג’ל structuration והפצה תא בתוך כל תרבות 3D מוזנח לעתים קרובות. לכן, רוב הניתוחים מתייחסים לתמונות 2D בודדות, המייצגות רק בערך את ההתפלגות של העצמים הסלולריים השונים בכל אמצעי האחסון התת-ממדי.
מחלות המשפיעות על תעלות מרה, כגון cholangiocarcinoma, אטרזיה המרה, cholangitis טרשת נפוצה העיקרית, בין היתר, הם הגורם העיקרי של תמותה ותחלואה. מלבד השתלת כבד, אין טיפולים יעילים עבור תנאים אלה13. המאמצים לחקור היווצרות צינור מרה, גורמים למחלות והתקדמות יאפשרו פיתוח של טיפולים חדשניים14.
מודלים organotypic מרה של ציסטות, spheroids או מבנים דמויי צינור באמצעות נורמלי או המטופל נגזר, מובדיל, או קווי תא cholangiocyte נגזר צוגנטור פותחו15 , 16,17,18,19,20. מחקרים שונים יש recapitulated קוטביות cholangiocyte, ביטוי של סמני cholangiocyte, נוכחות של סיליה, הפרשת cholangiocyte ויכולת ספיגה מחדש, היווצרות לומן וחסימה; כולם מייצגים מאפיינים חשובים של פנוטיפ צ’ולנגיוציט, מורפולוגיהופונקציה 15,17,19. אחרים דיווחו על תחזוקה של אורגנואידים מרים נגזר המטופל במשך פרקי זמן ארוכים20. לאחרונה, חקרנו את התפקיד של רמזים ביוכימיים וביופיזיים על ציסטות מרה organogenesis21. חשוב לציין, הפתוגנזה של אטרזיה מרה נחקרה ב spheroids מרה וצינורות7,22. יתר על כן, תכונות עיקריות של cholangitis טרשת נפוצה כגון סנסציה cholangiocyte, הפרשת ציטוקינות פרו דלקתיות, כמו גם גיוס מקרופאג נחקרו בהצלחה באמצעות spheroids מרה15,20. עם זאת, ניתן לשחזר במבחנה מודלים כמותיים 3D כי פיזיולוגי לווסת פנוטיפ cholangiocyte, פיזיולוגיה, ומיקרוסביבה שבו שאלות אלה ניתן לטפל עדיין נדרשים. יתר על כן, רק מעט פרסומים דיווחו על יעילות היווצרות ציסטה21,23. זוהי נקודה חשובה כדי לבסס, במיוחד בעת חקירת organogenesis, גורם למחלה, ומתאמת של תגובות סמים עם פונקציה cholangiocyte וקיטוב. בנוסף, עם הבדלים בפיגומים/מטריצה המשמשים מרוטוקול לפרוטוקול, קשה להשוות בין מערכות. כדי לפתור בעיות אלה, אנו מציעים שיטה כמותית, אמינה ואוניברסלית כדי ליצור ציסטות מרה מחקה היווצרות לומן, קיטוב cholangiocyte, ופונקציית הפרשת cholangiocyte. חשוב לציין, אנו מציגים ניתוח שיטתי המבוצע לאורך ציר ה-Z על-פני ג’ל תלת-ממדי בעת הערכה לאורך זמן, יעילות היווצרות ציסטה, גודל, כדאיות, קיטוב ופונקציונליות. יתר על כן, השתמשנו הידרוג’ל טבעי ו cholangiocytes חולדה נורמלי (NRC)s, כדוגמה לפרוטוקול, אבל הידרוג’לים טבעיים או סינתטיים אחרים, כמו גם תאים אפיתל יכול לשמש להיווצרות של מבנים סיסטיק 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
על מנת ללמוד organogenesis ותחזוקה של מבנים תאיים 3D, רקמות שונות כבר מודל, באמצעות מקורות תאיים שונים, אבל גם סוגים שונים של מטריצות חוץ תאי כוללהידרוג’לים סינתטיים 8,9,10,21. עם זאת, בשל היעדר ניתוח כמותי תלת-מידי המאפשר השוואות ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר ניקולס לרוסו (מאיו קליניק, רוצ’סטר, מינסוטה, ארצות הברית), אשר סיפק בחביבות את קו התא NRC.
עבודה זו זכתה לתמיכה כספית הן בתוכנית iLite RHU (להעניק ANR-16-RHUS-0005) והן של DHU Hepatinov.
אנו מודים לאיזבל גארסין ורוסו ד’אימליירי צלולייר פריז סקלי על תמיכתם בהדמיה.
Materials
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA – flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
References
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al. Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Current Biology. 18, 507-513 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix. Current Procotols in Cell Biology. , (2010).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).
- Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).
- Lorent, K., et al. Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia. Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).
- Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro. Biomaterials. 112, 20-30 (2017).
- Miroshnikova, Y. A., et al. Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties. Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).
- Ozdemir, T., et al. Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).
- Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D’hahan, N., Gidrol, X. Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development. Biomaterials. 52, 347-357 (2015).
- Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. Cholangiopathies – Towards a molecular understanding. EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).
- Loarca, L., et al. Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis. Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).
- De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. Regenerative medicine and the biliary tree. Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).
- Dianat, N. H., et al. Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology. 60, 700-714 (2014).
- Masyuk, A. I., et al. Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target. Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).
- Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).
- Soroka, J. C., et al. Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile. Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).
- Funfak, F., et al. Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).
- Du, Y., et al. Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions. Hepatology. , (2019).
- Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).
- Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment. International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death. Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).
- Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O’Hara, S. P., LaRusso, N. F. Physiology of Cholangiocytes. Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).
- Spirlì, C., et al. Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line. American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).
