דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור הפטיטיס B וירוס (HBV) זיהום בתאי 293T מהונדסים הרומן (293T-NE-3NRs, הבעת NTCP אנושי, HNF4α, RXRα ו PPARα) ותאי הכבד המסורתית (HepG2-NE, ביטוי האדם NTCP).
Abstract
HBV מדביק בעיקר את הפטוציטים האנושית, אבל זה גם נמצא להדביק רקמות חוץ הכבד כגון כליות ובנות. עם זאת, מודלים מבוססי תא hbv מוגבלים לקווי התאים של hepatoma (כגון HepG2 ו Huh7) על-ידי הבעת קולטן hbv תפקודית, סודיום טאורוכולאט הובלת פוליפטידים (ntcp). כאן, השתמשנו 293T-NE-3NRs (293T ביטוי יתר של האדם NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα) ו HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) כמו קווי תא דגם. הידבקות HBV בקווי תאים אלה בוצעה גם באמצעות חלקיקי וירוס HBV מרוכזים מ-HepG 2.2.15 או co-culturing HepG 2.2.15 עם קווי תא היעד. בוצעה כדי לאשר. זיהום של HBV שתי השיטות המוצגות כאן תסייע לנו ללמוד זיהום HBV בקווים שאינם תאי הכבד.
Introduction
צהבת B משפיע על חייהם של יותר מ-2,000,000,000 אנשים והוא אחד האיומים העיקריים לבריאות הציבור. כ 257,000,000 אנשים נגועים באופן כרוני עם צהבת B וירוס (HBV) ברחבי העולם, גרימת נטל גדול לחברה1. Hepatocytes הם לא התאים היחידים הנגועים על ידי hbv ותאים אחרים ברקמה שאינה הכבד, כגון כליות ובנות, הם נגועים גם על ידי וירוס זה2,3. כיום, מודלים תא הזיהום HBV מוגבלים האדם hepatocytes עם רק כמה מודלים שאינם הכבד קו התא. זה הסלים המחקר של זיהום HBV ו-HBV הקשורות הפתולוגיה של רקמות לא הכבד. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי ללמוד זיהום HBV בתאי 293T שאינם הכבד, כמו גם בתאים hepatoma מבוססי.
סודיום טאורוכולאט שיתוף פוליפטידים (ntcp) הוא קולטן תפקודית עבור צהבת האדם B ו הפטיטיס D וירוס4. Hepatocyte גורם גרעיני 4α (HNF4α), קולטן X retinoid α (rxrα) ו פראוקסיזום המופעל מפיצים מופעל α (pparα) הם הכבד מועשר שעתוק גורמים הגבלת tropism ויראלי של hbv. הם אומתו לקדם את הסינתזה של HBV RNA ותמיכה ב-HBV בשכפול התאיםבתוךקו שאינו תא 5. בנינו שלושה קווי תא שונים, HepG2 התאים קווי המבטא NTCP (HepG2-NE), 293T התא t המבטא NTCP (293T-NE) ו 293T התא t להביע ארבעה גנים מארחים; NTCP, HNF4α, RXRα ו PPARα (293T-NE-3NRs). שתי שיטות לזיהום HBV פותחו על בסיס 293T-NE-3NRs (איור 1). השיטה הראשונה משתמשת בחיסונים ב-293T-NE-3NRs עם שקילות הגנום ויראלי גבוהה (GEq גבוה (150), DMSO ו PEG8000) עבור 24 h. השיטה השנייה מעסיקה co-culturing 293T-NE-3NRs עם HepG 2.2.15, אשר יכול לייצר חלקיקי HBV (GEq נמוך (על 1.83) ללא DMSO ו PEG8000), ובכך היטב מחקות את התנאים הטבעיים.
התאים hepg 2.2.15 נגזרים מהקו HepG2 ובאופן כרוני מפרישות hbv זיהומיות, כמו גם חלקיקים תת ויראלי לתוך מדיום התרבות6,7. ציקלוספורין A (CsA) הוא מדכא חיסוני קליני המשמש לדיכוי דחייה של השתל. מחקרים הראו כי CsA מעכב את כניסת HBV לתוך החלציטים תרבותית על ידי עיכוב פעילות הטרנספורטר של NTCP וחסימת האיגוד של NTCP כדי חלבונים מעטפה גדולה8.
HepG2-NE תאים שימשו שליטה חיובית ואילו תאים שטופלו CsA שימשו שליטה שלילית. על ידי השוואת עם קבוצות שליטה חיוביות ושליליות, אנחנו יכולים לגלות אילו גנים מארחים לשחק תפקיד קריטי בזיהום HBV. בנוסף, באמצעות מצב זה של זיהום HBV, אנחנו יכולים גם למצוא מנגנונים חדשניים אחרים או גנים מארחים המעורבים בזיהום HBV.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור זיהום HBV בתוך 293T-NE-3NRs-מבוססי hepatoma תאים HepG2-NE. 293T-NE-3NRs היו מתאימים לזיהום HBV בשני גבוה ונמוך GEq. יש לקחת בחשבון את הצעדים הקריטיים הבאים תוך שימוש בפרוטוקול שלנו. מצב התא הוא גורם חשוב להידבקות מוצלחת. בינוני זיהום חייב להשתנות בזמן לאחר התקופה הראשונית של זיהום HB…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 81870432 ו 81570567 X.L.Z.), (No. 81571994 כדי P.N.S.), קרן מחקר למדענים צעירים בינלאומיים (No. 81950410640 ל-W.I.); הקרן האוניברסיטאי לShantou לי קה (לא. L1111 2008 לP.N.S.). ברצוני להודות לפרופ ‘ סטנלי לין מהמכללה לרפואה של אוניברסיטת Shantou לקבלת עצות שימושיות.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
