Modelagem da infecção por vírus da hepatite B em células não hepáticas 293T-NE-3NRs
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV) em novas células 293T (293T-NE-3NRs, expressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e células hepáticas tradicionais (HepG2-NE, expressando NTCP humano).
Abstract
O HBV infecta principalmente hepatócitos humanos, mas também foi encontrado para infectar tecidos extraháticos, como rim e testíase. No entanto, os modelos de HBV baseados em células estão limitados a linhas celulares hepatoma (como HepG2 e Huh7) superexpressando um receptor HBV funcional, polipeptídeo de taurocolato de sódio (NTCP). Aqui, usamos 293T-NE-3NRs (293T superexpressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e HepG2-NE (HepG2 superexpressando NTCP) como linhas de célula modelo. A infecção por HBV nessas linhas celulares foi realizada utilizando partículas concentradas do vírus HBV de HepG2.2.15 ou co-culminando hepG2.2.15 com as linhas celulares-alvo. A imunofluorescência HBcAg para HBcAg foi realizada para confirmar a infecção pelo HBV. Os dois métodos aqui apresentados nos ajudarão a estudar a infecção pelo HBV em linhas celulares não hepáticas.
Introduction
A hepatite B afeta a vida de mais de 2 bilhões de pessoas e é uma das maiores ameaças à saúde pública. Aproximadamente 257 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas com o vírus da hepatite B (HBV) em todo o mundo, causando um grande fardo para a sociedade1. Os hepatócitos não são as únicas células infectadas pelo HBV e outras células em tecido não hepático, como rim e testíase, também são infectados por este vírus2,,3. Atualmente, os modelos de células de infecção por HBV estão limitados a hepatócitos humanos com apenas poucos modelos de linha celular não hepática. Isso dificulta o estudo da infecção por HBV e da patologia relacionada ao HBV de tecidos não hepáticos. Aqui apresentamos protocolos para estudar a infecção por HBV em células 293T não hepáticas, bem como em células baseadas em hepatoma.
O polipeptídeo de co-transporte de taurocolato de sódio (NTCP) é um receptor funcional para hepatite B humana e vírus da hepatite D4. Fator nuclear hepatocito 4α (HNF4α), receptor X retinóide α (RXRα) e receptor ativado por proliferador peroxiso α (PPARα) são fatores de transcrição enriquecidos pelo fígado que restringem o tropismo viral do HBV. Eles foram verificados para promover a síntese de RNA pregenomic HBV e apoiar a replicação do HBV em uma linha celular não hepatoma5. Construímos três linhas celulares diferentes, linhas celulares HepG2 expressando NTCP (HepG2-NE), linha celular 293T expressando linha NTCP (293T-NE) e linha celular 293T expressando quatro genes hospedeiros; NTCP, HNF4α, RXRα e PPARα (293T-NE-3NRs). Dois métodos para infecção por HBV foram desenvolvidos com base em 293T-NE-3NRs(Figura 1). O primeiro método utiliza a inoculação em 293T-NE-3NRs com alta equivalência do genoma viral (GEq alto (150), DMSO e PEG8000) por 24 h. O segundo método emprega co-cultivar 293T-NE-3NRs com HepG2.2.15, que podem produzir partículas HBV (baixo GEq (cerca de 1,83) sem DMSO e PEG8000), assim emulando de perto as condições naturais.
As células hepG2.2.15 são derivadas da linha HepG2 e secretam cronicamente o HBV infeccioso, bem como partículas subvirais no meio da cultura6,,7. Ciclosporina A (CsA) é um imunossupressor clinicamente utilizado para a supressão da rejeição de xenoenxerto. Estudos têm demonstrado que a CSA inibe a entrada de HBV em hepatócitos cultivados inibindo a atividade de transporte do NTCP e bloqueando a vinculação do NTCP às grandes proteínas envelope8.
As células hepG2-NE foram utilizadas como controle positivo, enquanto as células tratadas com CIA foram utilizadas como controle negativo. Comparando-se com os grupos de controle positivos e negativos, podemos descobrir quais genes hospedeiros desempenham um papel crítico na infecção pelo HBV. Além disso, através deste modo de infecção por HBV, também podemos encontrar outros novos mecanismos ou genes de hospedagem envolvidos na infecção pelo HBV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, introduzimos protocolos para infecção por HBV em células Hepáticas 293T-NE-3NRs e hepatoma baseadas em HepG2-NE. 293T-NE-3NRs foram adequados para infecção por HBV tanto no Alto quanto no Baixo GEq. As seguintes etapas críticas devem ser levadas em consideração ao usar nosso protocolo. O estado celular é um fator importante para uma infecção bem sucedida. O meio de infecção deve ser alterado oportunamente após o período inicial de infecção por HBV. As células 293T-NE-3NRs são tipicamente frágei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (nº 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (Nº 81571994 para P.N.S.), Fundo de Pesquisa para Jovens Cientistas Internacionais (nº 81950410640 a W.I.); Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (Nº. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
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