Modellazione dell'infezione da virus dell'epatite B nelle cellule non epatiche 293T-NE-3NRs
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l’infezione da virus dell’epatite B (HBV) in nuove cellule 293T ingegnerizzate (293T-NE-3NRs, che esprime NTCP umana, HNF4, RXR e PPAR) e cellule epatiche tradizionali (HepG2-NE, che esprimono NTCP umani).
Abstract
L’HBV infetta principalmente gli epatociti umani, ma è stato anche trovato per infettare tessuti extraepatici come reni e testicoli. Ciò nonostante, i modelli HBV basati su cellule sono limitati alle linee cellulari dell’epatoma (come HepG2 e Huh7) sovraesprimendo un recettore HBV funzionale, il taurocholate di sodio co-trasportando polipeptide (NTCP). In questo caso, abbiamo utilizzato 293T-NE-3NRs (293T sovraesprimenti umani NTCP, HNF4, RXR e PPAR) e HepG2-NE (HepG2 sovraesprimendo NTCP) come linee cellulari del modello. L’infezione da HBV in queste linee cellulari è stata eseguita utilizzando particelle di virus HBV concentrate da HepG2.2.15 o co-culcolando HepG2.2.15 con le linee cellulari di destinazione. L’immunofluorescenza HBcAg per HBcAg è stata eseguita per confermare l’infezione da HBV. I due metodi qui presentati ci aiuteranno a studiare l’infezione da HBV nelle linee cellulari non epatiche.
Introduction
L’epatite B influisce sulla vita di oltre 2 miliardi di persone ed è una delle principali minacce per la salute pubblica. Circa 257 milioni di persone sono cronicamente infettate dal virus dell’epatite B (HBV) in tutto il mondo, causando un grande fardello per la società1. Gli epatociti non sono le uniche cellule infettate da HBV e altre cellule nel tessuto non epatico, come rene e testicoli, sono anche infettate da questo virus2,3. Attualmente, i modelli cellulari di infezione da HBV sono limitati agli epatociti umani con solo pochi modelli di linee cellulari non epatiche. Ciò ostacola lo studio dell’infezione da HBV e della patologia correlata all’HBV dei tessuti non epatici. Qui presentiamo protocolli per studiare l’infezione da HBV nelle cellule 293T non epatiche e nelle cellule a base di epatoma.
Il polipeptide co-trasporto del taurocholato di sodio (NTCP) è un recettore funzionale per l’epatite B umana e il virus dell’epatite D4. Il fattore nucleare di epatocita 4 (HNF4), il recettore X dei resinoidi ( ) e il recettore attivato dal proliferatore perossisoso (PPAR) sono fattori di trascrizione arricchiti di fegato che limitano il tropismo virale dell’HBV. Sono stati verificati per promuovere la sintesi dell’RNA pregenomico HBV e supportano la replicazione dell’HBV in una linea cellulare non epatoma5. Abbiamo costruito tre diverse linee cellulari, le linee cellulari HepG2 che esprimono NTCP (HepG2-NE), la linea cellulare 293T che esprime NTCP (293T-NE) e la linea cellulare 293T che esprime quattro geni ospiti; NTCP, HNF4, RXR e PPAR (293T-NE-3NRs). Sono stati sviluppati due metodi per l’infezione da HBV sulla base di 293T-NE-3NRs (Figura 1). Il primo metodo utilizza l’inoculazione in 293T-NE-3NR con elevata equivalenza genomica virale (alto GEq (150), DMSO e PEG8000) per 24 h. Il secondo metodo impiega la co-coltura 293T-NE-3NRs con HepG2.2.15, che può produrre particelle HBV (basso GEq (circa 1,83) senza DMSO e PEG8000), emulando così da vicino le condizioni naturali.
Le cellule HepG2.2.15 sono derivate dalla linea EpG2 e secernono cronicamente particelle infettive HBV, così come particelle subvirali nel mezzo di coltura6,7. La ciclosporina A (CsA) è un immunosoppressore clinicamente utilizzato per la soppressione del rifiuto dello xenotrapianto. Gli studi hanno dimostrato che la CA inibisce l’ingresso dell’HBV negli epotociti coltivati inibendo l’attività di trasporto di NTCP e bloccando il legame di NTCP a grandi proteine di inviluppo8.
Le cellule EpG2-NE sono state usate come controllo positivo, mentre le cellule trattate dalla CsA sono state usate come controllo negativo. Confrontandoci con i gruppi di controllo positivi e negativi, possiamo scoprire quali geni ospiti svolgono un ruolo fondamentale nell’infezione da HBV. Inoltre, attraverso questa modalità di infezione da HBV, possiamo anche trovare altri nuovi meccanismi o geni ospiti coinvolti nell’infezione da HBV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, introduciamo protocolli per l’infezione da HBV in 293T-NE-3NR non epatici e cellule HepG2-NE basate sull’epatoma. 293T-NE-3NRs erano adatti per l’infezione da HBV sia ad alto che a basso GEq. I seguenti passaggi critici devono essere presi in considerazione durante l’utilizzo del nostro protocollo. Lo stato della cellula è un fattore importante per un’infezione di successo. Il mezzo di infezione deve essere cambiato tempestivamente dopo il periodo iniziale dell’infezione da HBV. Le cellule 293T-NE-3NRs sono tipicam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81870432 e 81570567 a X.L.) (da n. 81571994 a P.N.S.), Fondo di ricerca per giovani scienziati internazionali (n. 81950410640 a W.I.); La Li Ka Shing Shantou University Foundation (n. Da L1111 2008 a P.N.S.). Ringraziamo il prof.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
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