非肝細胞293T-NE-3NRs細胞におけるB型肝炎ウイルス感染のモデル化
Summary
本稿では、新たに設計された293T細胞(293T-NE-3RS、ヒトNTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα)および伝統的な肝細胞(HepG2-NE、ヒトNTCPを発現する)におけるB型肝炎ウイルス(HBV)感染の詳細なプロトコルについて説明する。
Abstract
HBVは主にヒト肝細胞に感染するが、腎臓や精巣などの肝外組織に感染することも分かっていない。それにもかかわらず、細胞ベースのHBVモデルは、機能的HBV受容体、タウロコレート共輸送ポリペプチド(NTCP)を過剰発現するヘパトーマ細胞株(HepG2およびHuh7など)に限定される。ここでは、モデル細胞株として293T-NE-3ノール(293T過剰発現ヒトNTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα)およびHepG2-NE(HepG2過剰発現NTCP)を用いた。 これらの細胞株におけるHBV感染は、HepG2.2.15からの濃縮HBVウイルス粒子または標的細胞株との共培養HepG2.2.15を用いて行った。HBcAgに対するHBcAg免疫蛍光をHBV感染を確認するために実施した。ここで提示される2つの方法は、非肝細胞株におけるHBV感染を研究するのに役立ちます。
Introduction
B型肝炎は20億人以上の人々の生活に影響を与え、公衆衛生に対する大きな脅威の1つです。世界中で約2億5,700万人が慢性B型肝炎ウイルス(HBV)に感染しており、社会に大きな負担を与えています。肝細胞は、腎臓や精巣などの非肝組織におけるHBVおよび他の細胞に感染した唯一の細胞ではなく、このウイルス22、33にも感染している。現在、HBV感染細胞モデルは、非肝細胞系モデルの数が少ないヒト肝細胞に限定されている。これは、HBV感染および非肝組織のHBV関連病理の研究を妨げる。ここでは、非肝細胞293T細胞および肝細胞におけるHBV感染を研究するためのプロトコルを提示する。
タウロコレート酸共輸送ポリペプチド(NTCP)は、ヒトB型肝炎およびD型肝炎ウイルス4の機能受容体である。肝細胞核因子4α(HNF4α)、レチノイドX受容体α(RXRα)およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)は、HBVのウイルス性栄養を制限する肝富化転写因子である。それらは、HBVプレゲノムRNA合成を促進し、非ヘパトーマ細胞ライン5におけるHBV複製を支持することが確認されている。我々は、NTCP(HepG2-NE)を発現するHepG2細胞株、NTCP(293T-NE)を発現する293T細胞株、および4つの宿主遺伝子を発現する293T細胞株の3つの異なる細胞株を構築した。NTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα(293T-NE-3ノール)。HBV感染のための2つの方法は、293T-NE-3DRに基づいて開発された(図1)。第1の方法は、24時間の高いウイルスゲノム同等性(高いGEq(150)、DMSOおよびPEG8000を有する293T-NE-3ノンの接種を使用する。2番目の方法は、293T-NE-3NをHepG2.2.15と共培養し、DMSOおよびPEG8000なしでHBV粒子(約1.83)を生成し、自然条件を密接にエミュレートする。
HepG2.2.15細胞は、HepG2線に由来し、感染性HBVを慢性分泌し、ならびにサブウイルス粒子を培地66,77に分泌する。シクロスポリンA(CsA)は、異種移植片拒絶反応の抑制のために臨床的に用いられる免疫抑制剤である。研究は、CsAがNTCPのトランスポーター活性を阻害し、NTCPの大きなエンベロープタンパク質8への結合を遮断することによって培養肝細胞へのHBVの侵入を阻害することを示している。
HepG2-NE細胞は陽性対照として用いたのに対し、CsA処理細胞は陰性対照として用いた。陽性対照群と陰性対照群と比較することで、HBV感染においてどの宿主遺伝子が重要な役割を果たすかを調べることができる。さらに、HBV感染のこのモードを介して、HBV感染に関与する他の新しいメカニズムまたは宿主遺伝子を見つけることもできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、非肝293T-NE-3Nおよび肝腫ベースHepG2-NE細胞におけるHBV感染プロトコルについて紹介する。293T-NE-3NRsは、高および低GEqの両方でHBV感染に適していた。プロトコルを使用する際には、次の重要な手順を考慮する必要があります。細胞の状態は、感染を成功させるための重要な要因です。感染媒体は、HBV感染の最初の期間の後にタイムリーに変更する必要があります。293T-NE-3-3NRs細胞は、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(No. 81870432および81570567からX.L.Z.)(No. 81571994 to P.N.S.)、国際若手研究者研究基金(第81950410640語第81950410640語第81950410640)によって支援されました。李嘉誠山浦大学財団(No.L1111 2008からP.N.S.へ。シャントゥ大学医科大学のスタンリー・リン教授に有益なアドバイスをいただき、ありがとうございました。
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
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