Modellering hepatitt B Virus infeksjon i ikke-hepatisk 293T-NE-3NRs celler
Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for hepatitt B-virus (HBV) infeksjon i nye konstruerte 293T-celler (293T-NE-3NRs, uttrykker menneskelig NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og tradisjonelle leverceller (HepG2-NE, uttrykker menneskelig NTCP).
Abstract
HBV infiserer hovedsakelig humane hepatocytter, men det har også blitt funnet å infisere ekstrahepatisk vev som nyre og testis. Likevel er cellebaserte HBV-modeller begrenset til hepatomacellelinjer (som HepG2 og Huh7) som overutså en funksjonell HBV-reseptor, natriumtaurocholate co-transport polypeptid (NTCP). Her brukte vi 293T-NE-3NRs (293T overexpressing human NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) som modellcellelinjer. HBV-infeksjon i disse cellelinjene ble utført enten ved hjelp av konsentrerte HBV-viruspartikler fra HepG2.2.15 eller samtidig hepG2.2.15 med målcellelinjene. HBcAg immunofluorescens for HBcAg ble utført for å bekrefte HBV-infeksjon. De to metodene som presenteres her vil hjelpe oss med å studere HBV-infeksjon i ikke-levercellelinjer.
Introduction
Hepatitt B påvirker livene til mer enn 2 milliarder mennesker og er en av de store truslene mot folkehelsen. Omtrent 257 millioner mennesker er kronisk smittet med hepatitt B-virus (HBV) over hele verden, noe som forårsaker en stor byrde for samfunnet1. Hepatocytter er ikke de eneste cellene som er infisert av HBV og andre celler i ikke-levervev, som nyre og testis, er også smittet av dette viruset2,3. For tiden er HBV infeksjoncellemodeller begrenset til humane hepatocytter med bare få ikke-levercellelinjemodeller. Dette hindrer studien av HBV-infeksjon og HBV-relatert patologi av ikke-levervev. Her presenterer vi protokoller for å studere HBV-infeksjon i ikke-lever-293T-celler, så vel som i hepatomabaserte celler.
Natriumtaurolitt samtidig transport av polypeptid (NTCP) er en funksjonell reseptor for human hepatitt B og hepatitt D-virus4. Hepatocyt kjernefaktor 4α (HNF4α), retinoid X reseptor α (RXRα) og peroksisom proliferator-aktivert reseptor α (PPARα) er leverberikede transkripsjonsfaktorer som begrenser viral tropisme av HBV. De har blitt verifisert for å fremme HBV pregenomic RNA syntese og støtte HBV replikering i en nonhepatoma celle linje5. Vi konstruerte tre forskjellige cellelinjer, HepG2-cellelinjer som uttrykte NTCP (HepG2-NE), 293T cellelinje som uttrykker NTCP (293T-NE) og 293T cellelinje som uttrykker fire vertsgener; NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα (293T-NE-3NR). To metoder for HBV-infeksjon ble utviklet basert på 293T-NE-3NRs (figur 1). Den første metoden bruker inokulasjon i 293T-NE-3NRs med høy viral genom ekvivalens (høy GEq (150), DMSO og PEG8000) for 24 timer. Den andre metoden benytter co-culturing 293T-NE-3NRs med HepG2.2.15, som kan produsere HBV partikler (lav GEq (ca 1,83) uten DMSO og PEG8000), og dermed tett emulere naturlige forhold.
HepG2.2.15 celler er avledet fra HepG2-linjen og kronisk utskiller smittsomme HBV, samt subvirale partikler i kulturmediet6,7. Cyklosporin A (CsA) er et immunsuppressivt middel som er klinisk brukt til undertrykkelse av xenograft-avvisning. Studier har vist at CsA hemmer HBV-inntreden i kultiverte hepatocytter ved å hemme transportøraktiviteten til NTCP og blokkere bindingen av NTCP til store konvoluttproteiner8.
HepG2-NE-celler ble brukt som positiv kontroll, mens CsA-behandlede celler ble brukt som negativ kontroll. Ved å sammenligne med de positive og negative kontrollgruppene, kan vi finne ut hvilke vertsgener som spiller en kritisk rolle i HBV-infeksjon. I tillegg, gjennom denne modusen for HBV-infeksjon, kan vi også finne andre nye mekanismer eller vertsgener involvert i HBV-infeksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introduserer vi protokoller for HBV-infeksjon i ikke-hepatiske 293T-NE-3NRs og hepatomabaserte HepG2-NE-celler. 293T-NE-3NRs var egnet for HBV-infeksjon ved både høy og lav GEq. Følgende kritiske tiltak må tas i betraktning mens du bruker protokollen vår. Cellestatusen er en viktig faktor for en vellykket infeksjon. Infeksjonsmediet må endres i tide etter den første perioden med HBV-infeksjon. 293T-NE-3NRs celler er vanligvis skjøre etter infeksjon med høye virale titers. Derfor må disse cellene vaskes fors…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 81870432 og 81570567 til X.L.Z.), (nr. 81571994 til P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (nr. 81950410640 til W.I.); Stiftelsen Li Ka Shing Shantou University (nr. L1111 2008 til P.N.S.). Vi vil gjerne takke prof. Stanley Lin fra Shantou University Medical College for nyttige råd.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
