Hepatik Olmayan 293T-NE-3NR Hücrelerinde Hepatit B Virüs Enfeksiyonunun Modelilmesi
Summary
Bu el yazması, insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα’yı ifade eden 293T-NE-3NR’ ler ve geleneksel hepatik hücreler (HepG2-NE, insan NTCP’yi ifade eden) yeni mühendislik temalı 293T hücreleri (293T-NE-3NR) enfeksiyonu için ayrıntılı bir protokol açıklar.
Abstract
HBV esas olarak insan heatositlerini enfekte eder, ancak böbrek ve testis gibi ekstrahepatik dokulara da bulaşabilmekte bulunmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı HBV modelleri hepatoma hücre hatları ile sınırlıdır (HepG2 ve Huh7 gibi) fonksiyonel BIR HBV reseptörü aşırı ifade, sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP). Burada 293T-NE-3NR (293T aşırı insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα) ve HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) model hücre hatları olarak kullandık. Bu hücre hatlarındaki HBV enfeksiyonu ya HepG2.2.15’teki konsantre HBV virüs parçacıkları kullanılarak ya da hepg2.2.15’i hedef hücre hatları ile birlikte örme ile gerçekleştirildi. HBV enfeksiyonunu doğrulamak için HBcAg immünoresans iması yapıldı. Burada sunulan iki yöntem, hepatik olmayan hücre hatlarında HBV enfeksiyonu çalışmamıza yardımcı olacaktır.
Introduction
Hepatit B 2 milyardan fazla insanın hayatını etkiler ve halk sağlığıiçin en büyük tehditlerden biridir. Yaklaşık 257 milyon kişi kronik hepatit B virüsü ile enfekte (HBV) dünya çapında, toplum için büyük bir yük neden1. Hepatositler hbv ve diğer hücreler tarafından enfekte olmayan karaciğer dokusu, böbrek ve testis gibi enfekte sadece hücreler değildir, ayrıca bu virüs tarafından enfekte2,3. Şu anda, HBV enfeksiyon hücre modelleri sadece birkaç non-hepatik hücre hattı modelleri ile insan hepatositleri ile sınırlıdır. Bu, hepatik olmayan dokuların HBV enfeksiyonu ve HBV ile ilişkili patolojisinin çalışmasını engellemektedir. Burada hepatik olmayan 293T hücrelerinde ve hepatom bazlı hücrelerde HBV enfeksiyonu incelemek için protokoller salıyoruz.
Sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP) insan hepatit B ve hepatit D virüsü için fonksiyonel bir reseptördür4. Hepatosit nükleer faktör 4α (HNF4α), retinoid X reseptörα (RXRα) ve peroksizom proliferator aktive reseptör α (PPARα) HBV viral tropizmkısıtlar karaciğer zenginleştirilmiş transkripsiyon faktörleridir. HbV pregenomik RNA sentezini teşvik etmek ve nonhepatom anormal hücre hattı5HBV replikasyonunu desteklemek için doğrulanmıştır. NTCP (HepG2-NE), NTCP (293T-NE) ve dört konak geni ifade eden 293T hücre hattını ifade eden HepG2 hücre hattı olmak üzere üç farklı hücre hattı inşa ettik; NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα (293T-NE-3NR). HBV enfeksiyonu için 293T-NE-3NR(Şekil 1)temel alınabilmektedir. İlk yöntem 293T-NE-3NR’de yüksek viral genom eşdeğerliği (yüksek GEq (150), DMSO ve PEG8000) 24 saat boyunca aşılama yöntemidir. İkinci yöntem, HBV partiküllerini (düşük GEq (yaklaşık 1,83) DMSO ve PEG8000 olmadan üretebilen ve böylece doğal koşulları yakından taklit eden HepG2.2.15’li 293T-NE-3NR’leri ortak olarak kullanır.
HepG2.2.15 hücreleri HepG2 hattından elde edilir ve kronik olarak enfeksiyöz HBV salgılar, ayrıca kültür ortamına subviral partiküller6,7. Siklosporin A (CsA) klinik olarak ksenogreft rekontisyonunun bastırılmasında kullanılan bir immünsupresandır. Çalışmalar, CsA’nın NTCP’nin taşıyıcı aktivitesini inhibe ederek ve NTCP’nin büyük zarf proteinlerine bağlanmasını engelleyerek HBV’nin kültürlü hepatositlere girişini engellediğini göstermiştir8.
HepG2-NE hücreleri pozitif kontrol olarak, CsA tedavi edilen hücreler ise negatif kontrol olarak kullanıldı. Pozitif ve negatif kontrol grupları ile karşılaştırarak, hangi konak genlerin HBV enfeksiyonunda kritik bir rol oynadığını bulabiliriz. Ayrıca, HBV enfeksiyonu bu modu ile, biz de diğer yeni mekanizmalar veya EV sahibi genler HBV enfeksiyonu dahil bulabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada hepatik olmayan 293T-NE-3NR ve hepatom bazlı HepG2-NE hücrelerinde HBV enfeksiyonu için protokoller sokulduk. 293T-NE-3NR hem yüksek hem de düşük GEq’da HBV enfeksiyonu için uygundu. Protokolümüzü kullanırken aşağıdaki kritik adımların göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Hücre durumu başarılı bir enfeksiyon için önemli bir faktördür. HBV enfeksiyonunun başlangıç döneminden sonra enfeksiyon ortamı zamanında değiştirilmelidir. 293T-NE-3NR hücreleri genellikle yüksek viral …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81870432 ve 81570567 X.L.Z.), (No. 81571994 P.N.S.), Uluslararası Genç Bilim Adamları Araştırma Fonu (No. 81950410640-W.I.); Li Ka Shing Shantou Üniversitesi Vakfı (No. L1111 2008 için P.N.S.). Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden Prof. Stanley Lin’e faydalı tavsiyeler için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
