Modellering hepatitis B-virusinfectie in niet-leverloze 293T-NE-3NRs-cellen
Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor hepatitis B-virus (HBV) infectie in nieuwe 293T cellen (293T-NE-3NRs, uitdrukken van menselijke NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en traditionele levercellen (HepG2-NE, uitdrukken van menselijke NTCP).
Abstract
HBV infecteert voornamelijk menselijke hepatocyten, maar het is ook gevonden om extrahepatische weefsels zoals nier en testis te infecteren. Niettemin zijn op cel gebaseerde HBV-modellen beperkt tot hepatoma-cellijnen (zoals HepG2 en Huh7) die een functionele HBV-receptor overdonderen, natrium taurocholaat co-transporteren polypeptide (NTCP). Hier gebruikten we 293T-NE-3NRs (293T overexpressing human NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als modelcellijnen. HBV-infectie in deze cellijnen werd uitgevoerd door het gebruik van geconcentreerde HBV-virusdeeltjes uit HepG2.2.15 of co-culturing HepG2.2.15 met de doelcellijnen. HBcAg immunofluorescentie voor HBcAg werd uitgevoerd om HBV-infectie te bevestigen. De twee methoden hier gepresenteerd zal ons helpen studie HBV infectie in niet-levercellijnen.
Introduction
Hepatitis B beïnvloedt het leven van meer dan 2 miljard mensen en is een van de grootste bedreigingen voor de volksgezondheid. Ongeveer 257 miljoen mensen zijn chronisch besmet met het hepatitis B-virus (HBV) wereldwijd, waardoor een grote last voor de samenleving1. Hepatocyten zijn niet de enige cellen besmet met HBV en andere cellen in niet-leverweefsel, zoals nier- en testis, zijn ook geïnfecteerd door dit virus2,3. Momenteel, HBV infectie cel modellen zijn beperkt tot menselijke hepatocyten met slechts enkele niet-levercellijn modellen. Dit belemmert de studie van HBV-infectie en HBV-gerelateerde pathologie van niet-leverweefsels. Hier presenteren we protocollen om HBV-infectie te bestuderen in niet-levermatige 293T-cellen en in op hepatoma gebaseerde cellen.
Natrium taurocholaat co-transport polypeptide (NTCP) is een functionele receptor voor human hepatitis B en hepatitis D virus4. Hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α), retinoïde X receptor α (RXRα) en peroxisome proliferator-geactiveerde receptor α (PPARα) zijn met de lever verrijkte transcriptiefactoren die het virale tropisme van HBV beperken. Ze zijn geverifieerd om hbv pregenomic RNA synthese te bevorderen en HBV-replicatie te ondersteunen in een nonhepatoma-cellijn5. We bouwden drie verschillende cellijnen, HepG2-cellijnen die NTCP (HepG2-NE) uitdrukken, 293T-cellijn die NTCP (293T-NE) en 293T-cellijn uitdrukken die vier gastheergenen uitdrukken; NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα (293T-NE-3NRs). Twee methoden voor HBV-infectie werden ontwikkeld op basis van 293T-NE-3NRs (figuur 1). De eerste methode maakt gebruik van inenting in 293T-NE-3NRs met een hoge virale genoom equivalentie (hoge GEq (150), DMSO en PEG8000) voor 24 uur. De tweede methode maakt gebruik van co-culturing 293T-NE-3NRs met HepG2.2.15, die HBV-deeltjes (lage GEq (ongeveer 1,83) zonder DMSO en PEG8000 kan produceren, waardoor de natuurlijke omstandigheden nauw kunnen worden geëmulgeerde.
HepG2.2.15 cellen zijn afgeleid van de HepG2 lijn en chronisch afscheiden besmettelijke HBV, evenals subvirale deeltjes in de cultuur medium6,7. Cyclosporin A (CsA) is een immunosuppressivum dat klinisch wordt gebruikt voor de onderdrukking van xenograftafstoting. Studies hebben aangetoond dat CsA de toegang van HBV tot gekweekte hepatocyten remt door de transportactiviteit van NTCP te remmen en de binding van NTCP aan grote envelopeiwitten te blokkeren8.
HepG2-NE cellen werden gebruikt als positieve controle, terwijl CsA behandelde cellen werden gebruikt als negatieve controle. Door te vergelijken met de positieve en negatieve controlegroepen, kunnen we erachter komen welke gastheergenen een cruciale rol spelen bij HBV-infectie. Bovendien, door middel van deze wijze van HBV-infectie, kunnen we ook andere nieuwe mechanismen of gastheer genen die betrokken zijn bij HBV-infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier introduceren we protocollen voor HBV-infectie in niet-leverige 293T-NE-3NRs en hepatoma-gebaseerde HepG2-NE cellen. 293T-NE-3NRs waren geschikt voor HBV-infectie bij zowel hoge als lage GEq. Bij het gebruik van ons protocol moet rekening worden gehouden met de volgende kritieke stappen. De celstatus is een belangrijke factor voor een succesvolle infectie. Het infectiemedium moet tijdig worden gewijzigd na de eerste periode van HBV-infectie. 293T-NE-3NRs cellen zijn meestal kwetsbaar na infectie met hoge virale titer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81870432 en 81570567 tot X.L.Z.), (nr. 81571994 tot P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (nr. 81950410640 tot W.I.); De Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 aan P.N.S.). Wij willen prof. Stanley Lin van het Shantou University Medical College bedanken voor nuttig advies.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
