熱帯熱マラリア原虫 人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

Summary

マラリア原虫の蚊の段階に関する詳細な調査は、効果的な伝染遮断戦略を設計するために重要です。このプロトコルは、感染性のタテキを効果的に培養し、これらのタテライトを蚊に供給して P.熱帯熱砂の蚊の段階を生成する方法を示しています。

Abstract

マラリアは依然として最も重要な公衆衛生上の問題の1つであり、重大な罹患率と死亡率を引き起こしている。マラリアは、雌の アノフェレス 蚊からの感染性咬傷を介して伝染する蚊媒介性疾患である。マラリア対策は、最終的には蚊との間の感染を遮断する方法を含む多数のアプローチに依存します。マラリア原虫の蚊の段階を実験室で研究するために、ヒト宿主から蚊ベクターへの感染に必要な寄生虫ステージである感染性の高い熱帯 熱マラリア 原虫の宿虫細胞を培養するプロトコルを最適化しました。 P. 熱帯熱透析 細胞は、5つの形態学的に異なるステップを経て成熟し、およそ1〜2週間かかる。このプロトコルに記載されているガテサイト培養は15日で完了し、15〜18日目から蚊に感染する。これらのプロトコルは、感染有能なタテライトの連続的なサイクルを維持し、寄生虫の蚊の段階の途切れない供給を維持するために開発されました。ここでは、食細胞培養の方法論と、ガラス膜フィーダーを用いてこれらの寄生虫に感染する方法について述べる。

Introduction

マラリアは マラリア原 虫寄生虫によって引き起こされ、雌 のアノフェレス 蚊の感染性咬傷を介して脊椎動物の宿主に伝染する。2019年の世界保健機関(WHO)の報告書によると、マラリアの合計2億2,800万例から推定405,000人の死亡^{がありました。}マラリア関連死のほとんどはアフリカ地域、特に5歳未満の小児に集中していた。マラリアの全体的な発生率は2010年から世界的に低下していますが、近年は減少が高まっており、この病気を排除するために追加の制御戦略が緊急に必要とされています。

マラリア原虫の周期性無性血液段階は病因を引き起こし、これらの小さなサブセットは女性と男性の解血細胞に分化する。熱帯熱マラリア原虫のテジカルは、5つの形態学的に異なる段階を経て開発するのに7〜10日かかるため、本質的にユニークです。第1段階からIV期までの未熟な食細胞は骨髄小板に隔離され、末梢循環^{2、3、4、5}にはほとんど欠けている。成熟期Vのゲームサイトに感染した赤血球は、血流中に放出され、蚊によって取り込まれるように自由に循環する。蚊の中に入ると、タレトサイトは、温度の変化と中腸環境への暴露を通じて活性化され、メスとオスの配偶体に変身し、蚊の唾液腺^6、7のスポロゾアテの感染段階で最高潮に達する蚊の段階の開発を開始する。

TragerとJenson⁸はP.熱帯熱化を培養するための標準化された方法を説明したので、無性血液段階に関する研究は大幅に進歩している。しかし、性的段階のための信頼性の高い文化システムの欠如は、P.熱帯熱マラリア類、伝染生物学および蚊の段階を研究することを困難にしている。近年、数種類の方法が発表され、その中で、9、10、11、12^の培養を確立する研究所が発表されている。本稿は、マラリア研究コミュニティにとって貴重な資源を表すことができるP.熱帯熱マラリア原虫を培養するための標準化された信頼性の高いプロトコルを記述する。この方法は、標準化された蚊の供給プロトコルと共に、信頼性の高い蚊の感染性をもたらす成熟した、感染性のタメサイトの堅牢な生産を可能にする。これらの方法は、ゲームトサイト、および蚊の段階寄生虫の途切れない供給を維持するために確立された。本稿では、完全な食塩基細胞培養プロトコル(図1)、ガラス膜フィーダーの調製、これらの膜フィーダーを用いた蚊の感染(図2)、蚊の中腸(図3)の解剖および唾液腺の解剖(図4)、中腸および唾液腺切断後の蚊の感染の定量について述べる。

Protocol

以下に記載の採血はジョンズ・ホプキンス大学の機関審査委員会によって承認されています。 P.熱帯熱砂 は、生体安全レベル2(BSL2)施設で無菌状態で新鮮なRBCで培養され、生体材料を扱う際に注意が必要です。血液または血液製剤を含む各ステップの後、すべてのプラスチック製品またはガラス製品は、適切な処分の前にフード内の10%漂白剤ですすがされます。 1. ?…

Representative Results

ここでは、上記のプロトコルを使用して生成された P.ファルシカルNF54 食塩細胞培養物を用いた一連の膜供給の結果を提示します(図5参照)。テマトサイト培養は0日目に約0.5%の混合無性培養で開始され、4日目と5日目までに約15%のピーク寄生虫症に成長しました。この高寄生症で 図5A に示すように、寄生虫はストレスを受け、無性期の培養が…

Discussion

ここで説明する方法は^{、10年以上の}ジョンズ・ホプキンスマラリア研究所で15^{年以上、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22}年以上にわたって使用されています。このプロトコルを用いて…

Materials

10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media